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永生化人肝细胞系的建立和生物学特性研究

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目的：构建永生化人肝细胞系,并对其生物学特性及某些功能进行研究,评价其作为生物人工肝种子细胞的可行性。rn 方法：利用慢病毒表达载体对原代培养的正常人肝细胞稳定转染人端粒酶逆转录酶基因(H-TERT)和抑制Caspase-3表达的siRNA,建立永生化人肝细胞系HepGL。以噻唑蓝法测定其生长曲线,并分析其染色体核型; RT-PCR测定其相关功能基因和表面标志基因表达; 蛋白印记法和免疫细胞化学检测肝功能相关蛋白表达; 酶联免疫法检测其白蛋白和尿素合成功能。裸鼠皮肤接种和软琼脂克隆试验观察细胞致瘤性。rn 结果：所建立的永生化人肝细胞HepGL具有原代肝细胞的典型形态特征,而且具有较好的增殖能力,细胞倍增时间为36小时。染色体核型分析表明细胞核型无明显异常;RT-PCR检测HepGL可以表达ALB,P450 3A4,ASGPR,GS,GST-π,HBCFoX,HNF4,CK18mRNA：蛋白印记法测定ALB表达与原代肝细胞相当; 免疫细胞化学检测ALB阳性表达显著; 酶联免疫法检测HepGL白蛋白表达最高可以达到(1000±0.8),ng/24h/105 cells,尿素合成量最高可以达到(30±0.5)umol/24h/105 cells,软琼脂集落形成实验表明HepGL在软琼脂中不能生长; 裸鼠皮肤接种部位及各脏器均未见有肿瘤形成。rn 结论:本研究建立的永生化人肝细胞系HepGL具有与原代肝细胞类似的形态特征和生物学功能,可以成为生物人工肝及肝细胞移植研究中理想的种子细胞材料。

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