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猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-1ike毒株CHsx1401感染性克隆的构建

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猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种危害全球养猪业的重要病原.近年来,PRRSV NADC30-1ike在我国出现并快速传播,造成猪场PRRS疫情暴发.同时,该毒株在流行过程中快速演化与变异,并且与我国高致病性毒株等发生重组出现新的毒株.本研究以NADC30-1ike毒株CHsx1401为对象,利用反向遗传操作技术成功构建出该毒株的感染性克隆.基于CHsx1401的全基因组序列，分四段设计引物，采用RT-PCR扩增基因组全长，其扩增cDNA片段长度分别为3156 bp、4164 bp、4283 bp和3439bp，将其分别克隆到pjETl.2载体。对4个片段的克隆分别进行测序鉴定，并与原始毒株序列进行比对，发现其中存在4个碱基的突变，用定向点突变方法对其进行回复突变，经序列测定证实后将4个克隆依次连接并克隆到改造的低拷贝质粒载体pWSK29（在原有载体的基础上在5’端引入CMV启动子，在3’端引入丁型肝炎病毒核酶），获得该毒株全长cDNA克隆pWSK-CHsx1401。在全长cDNA克隆的C与D片段之间通过同义突变(T11582G)引入ASC I酶切位点，作为遗传标记用于与亲本毒区分，并在序列的3’端引入了poly (A) 38序列。利用脂质体LTX将构建的全长cDNA克隆pWSK-CHsx1401转染MARC-145细胞，96h后收获细胞培养液进行传代，观察细胞病变。结果表明，第2代即可观察到典型的PRRSV细胞病变。经间接免疫荧光和RT-PCR以及测序鉴定表明，构建的全长cDNA克隆具有感染性，并可成功拯救出病毒（命名为RvCHsx1401）。拯救病毒在MARC-145细胞和原代猪肺泡巨噬细胞（PAMs）上的增殖动态与亲本病毒相似，但在各时相的病毒滴度略低于亲本病毒。综上所述，NADC30-like毒株CHsx1401的感染性克隆的成功构建为进一步研究其变异与致病的分子机制奠定了必要的技术平台。

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来源
《2016第六届中国兽药大会（中国畜牧兽医学会动物药品学分会第五届全国会员代表大会暨2016学术年会、中国微生物学会兽医微生物学专业委员会、中国畜牧兽医学会生物制品学分会2016年联合学术大会）》|2016年|42-43|共2页
会议地点成都
作者
卞婷; 周磊; 盖新娜; 郭鑫; 韩军; 杨汉春;
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作者单位

中国畜牧兽医学会;

中国微生物学会;

中国兽医协会;

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会议组织
正文语种
原文格式 PDF
中图分类家畜病毒学;
关键词
猪繁殖与呼吸综合征病毒; 感染性克隆; 反向遗传操作; 基因序列;

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