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首页> 中文会议>2016第六届中国兽药大会（中国畜牧兽医学会动物药品学分会第五届全国会员代表大会暨2016学术年会、中国微生物学会兽医微生物学专业委员会、中国畜牧兽医学会生物制品学分会2016年联合学术大会） >猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建与病毒拯救

猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建与病毒拯救

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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以急性肠炎、腹泻、呕吐、脱水为主要特征的一种高度接触性肠道传染病.各年龄段猪均对PEDV易感,其中哺乳仔猪的发病率和死亡率可达100％.2010年以来,PED在我国暴发并广泛流行,给养猪生产造成了巨大经济损失.笔者从发病猪场分离鉴定出1株PEDV,命名为BJ-2011-C.全基因组序列测定和分析表明,该毒株S蛋白存在特征性的变异,即在55-56位、135-136位氨基酸之间分别有4个氨基酸(GENQ)和1个氨基酸(N)的插入,以及155-156位氨基酸(DG)的缺失.经动物感染试验表明,BJ-2011-C属强毒株.同时,从疫苗免疫猪场分离到1株弱毒株,命名为CHM2013,与泰国毒株AVCT12和韩国毒株SM98基因组高度同源(99％),且在S基因和ORF3基因均存在碱基缺失.利用BAC载体作为骨架载体，插入CMV启动子、丁型肝炎病毒核酶序列(HDV)及牛生长激素(BGH)等元件，构建出PEDV BJ-2011-C和CHM2013的全长克隆质粒pBACBJ-2011-C和pBAC-CHM2013，并在BJ-2011-C的15932位和CHM2013的1809位引入遗传标记用于区分拯救病毒与亲本病毒。分别将重组质粒pBACBJ-2011-C、pBAC-CHM2013直接转染VERO-CCB81细胞并进行传代，可观察到与亲本病毒相同的细胞病变。提取第二代拯救病毒基因组并进行RT-PCR检测及测序，可检测到遗传标记。利用PEDV N蛋白单克隆抗体4E3进行间接免疫荧光实验可观察到感染阳性细胞。由此表明，构建的全长重组质粒pBACBJ-2011-C、pBAC-CHM2013具有感染性，可拯救出病毒。多步增殖曲线结果表明，拯救病毒rBJ-2011-C和rCHM2013与其亲本病毒具有相同的增值动态。动物实验表明，rBJ-2011-C可致2日龄哺乳仔猪严重的腹泻，致死率为100%，而rCHM2013感染仔猪无临床表现。综上结果表明，成功建立了PEDV强、弱毒株的反向遗传操作平台，为深入研究PEDV的致病性机制以及新型疫苗的研究奠定了基础。

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