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大鼠共表达GSK3β及EGFP基因病毒载体构建及转染骨髓间充质干细胞

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目的:构建携带大鼠GSK3β基因的逆转录病毒载体,并转染骨髓间充质干细胞,为研究GSK3β在骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中的作用打下坚实基础。方法:利用特异性引物,使用RT-PCR方法扩增GSK3β片段,将目的片段与pMD18T载体连接,经转化、扩增、抽取后,阳性克隆送测序。利用双酶切将GSK3β基因定向插入同携带EGFP基因的逆转录病毒表达质粒,进行双酶切及测序鉴定。将鉴定成功的逆转录病毒质粒和另外两种辅助质粒用磷酸钙法共转染293T细胞，收集、浓缩逆转录病毒及利用荧光计数法检测滴度。从成年SD大鼠股骨分离培养骨髓间充质干细胞，利用流式细胞法检测骨髓间充质细胞干细胞相关表面抗原标记物CD44(+),CD90(+),CD45(-)进行鉴定。获得的逆转录病毒载体感染骨髓间充质干细胞后，利用流式细胞仪检测转染率，并观察目的基因及绿色荧光表达情况。结果:RT-PCR产物经电泳及测序证实成功完成GSK3β基因克隆，酶切及测序鉴定成功构建重组逆转录病毒质粒，三质粒共转染293T细胞后72小时大部分细胞表达绿色荧光，病毒滴度为1×109TU/ml。培养的骨髓间充质干细胞为梭形成纤维样，流式细胞法显示其CD44,CD90的阳性表达率分别为99.67%,96.38%,CD45阴性率达99%以上。逆转录病毒载体感染后，骨髓间充质干细胞表达较强绿色荧光蛋自且GSK3βmRNA的表达上升，流式细胞仪检测转染率为67.1%。结论:成功构建GSK3β基因及EGFP基因共表达的逆转录病毒载体，并成功转染骨髓间充质干细胞。

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来源
《第25届全国脊柱脊髓学术会议暨2013年贵州省骨科年会》|2013年|234-235|共2页
会议地点贵阳
作者
李进; 贺西京; 程志坚; 兀飞;
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作者单位

中国残疾人康复协会;

国际脊髓学会;

中国脊髓损伤学会;

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会议组织
正文语种
原文格式 PDF
中图分类神经生理学;
关键词
骨髓间充质干细胞; 神经细胞分化; GSK3β基因; 动物实验;

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