• 主题
高级搜索  >
历史搜索 清空历史
首页> 中文会议>中华医学会第十五次全国心血管病学大会 >pEGFP-C1-CAR真核表达载体的构建及在原代培养的乳鼠心肌细胞的表达

pEGFP-C1-CAR真核表达载体的构建及在原代培养的乳鼠心肌细胞的表达

页面导航
  • 摘要
  • 著录项
  • 相似文献
  • 相关主题

摘要

目的：克隆C57BL/6鼠CAR基因,与pEGFP-C1质粒载体连接,转染原代培养的C57BL/6乳鼠心肌细胞,检测CAR的表达.方法：查找CAR基因序列,根据CAR基因开放阅读框架设计合适引物.提取C57BL/6胎鼠心脏总RNA,逆转录合成cDNA,利用引物5′-CCTCTAGACCCAGCCGAGATCGTTT-3′和5′-CCGTCGACAAGAAACGAGCCACGGAC-3′扩增CAR基因,通过XbaI和SalI酶切后纯化,与pBluescriptⅡKS+载体连接,进行转化、蓝白筛选及测序鉴定,构建pBlue-CAR 载体.从所得载体上利用引物5'-GGCTCGAGGTatggcgcgcctactgtgc-3‘和5‘-CCGAATTCTATACTATAGACCCGTC-3‘扩增CAR基因，通过XhoI和EcoRI酶切后纯化连接至pEGFP-C1载体，构建重组质粒pEGFP-CI-CAR，经PstI酶切线性化后进行测序鉴定。实验设置2个处理组，经测序鉴定正确的阳性克隆采用LipofectamineHP转染原代培养的C57BL/6乳鼠心肌细胞作为pEGFP-CI-CAR载体转染组，以pEGFP-C1空载体转染心肌细胞作为对照组，分别在于转染后12h,24h,48h,72h，采用RT-qPCR及Western-Blot鉴定其在心肌细胞的表达，倒置荧光显微镜观察EGFP的表达，计算转染效率。结果:得到pEGFP-CI-CAR基因序列。倒置荧光显微镜观察发现转染后24h乳鼠心肌细胞表达EGFP,转染效率达20%。RT-qPCR及Western-Blot示小鼠心肌细胞pEGFP-C1-CAR载体转染后24h CAR表达明显升高。结论：成功克隆C57BL/6鼠CAR基因并构建pEGFP-C:1-CAR真核表达载体，且在小鼠心肌细胞的表达获得成功，为进一步研究CAR在病毒性心肌炎发病机制中的作用奠定了基础。

著录项

相似文献

  • 中文文献
  • 外文文献
  • 专利
获取原文

客服邮箱：kefu@zhangqiaokeyan.com

京公网安备：11010802029741号 ICP备案号：京ICP备15016152号-6 六维联合信息科技 (北京) 有限公司©版权所有

  • 客服微信

  • 服务号