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巴西固氮螺菌Sp7中与NifA相互作用的阳性因子的基因克隆和功能分析

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Ⅰ综述部分：第一章固氮螺菌的固氮调控研究

Ⅰ综述部分：第二章酵母双杂交系统介绍

Ⅰ综述部分：第三章目的基因克隆的策略

Ⅱ论文部分：第四章材料与方法

Ⅱ论文部分：第五章结果与讨论

参考文献

致谢

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摘要

巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)Sp7是一种联合固氮菌，与其他固氮细菌一样，在该菌中NifA蛋白(nifA基因的产物)是固氮基因(nif基因)的转录激活蛋白。环境因子氧和铵对固氮作用的影响是通过调控nifA基因的表达和NifA蛋白的活性来实现的。目前，在该菌中既没有发现类似FixL/J双组分调节系统，也没有发现NifL蛋白。因此，氧和铵对NifA蛋白活性的调节机制有待进一步研究。 本研究室利用酵母双杂交系统，以NifA蛋白为诱饵，从A.brasilenseSp7染色体DNA文库中筛选到四个和NifA蛋白有直接相互作用的蛋白的编码基因。DNA序列分析表明，这四个阳性克隆包含了1～1.3kb不等的不完整的基因片段，与pGAD-C(X)载体构成融合质粒，依赖于载体起始翻译和终止。为了研究其功能，在本研究中，对这四个阳性克隆进行了全序列的克隆和进一步的功能分析。通过基于同源重组获得单交换突变体后，对单交换突变体染色体总DNA进行酶切、自连、转化筛选阳性克隆重组质粒的方法，分别得到了含有上下游未知序列的S4克隆11kb；S35(即org35)克隆10.6kb；S64克隆13.7kb和S65(即fhuE)克隆15.7kb。其中，S65(即fhuE)克隆已证明与铁转运有关。S35(即org35)克隆的编码蛋白为736个氨基酸(78.4kD)。序列比较分析表明，Org35蛋白可分成3个独立的结构域：N端PAS结构域，中间区组氨酸激酶结构域(HPK)和C端响应调节蛋白结构域(RR)，同源比对结果显示它是一个含有PAS结构域的杂合双组分调节系统，这是在巴西固氮螺菌中首次发现的杂合双组分系统。为了确定Org35蛋白中哪一个结构域与NifA蛋白有直接的相互作用，构建了包括PAS结构域的全长org35基因，缺失PAS结构域的org35基因，HPK结构域和RR结构域的pGAD-C(X)重组融合质粒，酵母双杂交实验结果证明Org35与NifA之间的相互作用是由PAS结构介导的，这一结果与国外报道的PAS结构域介导蛋白与蛋白之间的相互作用相一致。在A.brasilenseSp7中，NifA蛋白由三个结构域组成：N端的调节区域，中间的催化区域和C端的与DNA结合区域。为了进一步研究NifA不同区域与Org35蛋白的相互作用关系，又构建了pGBD-org35等重组融合质粒与NifA的不同区域共转化酵母细胞确定蛋白间的相互作用，结果显示NifA的N端介导了NifA蛋白与Org35蛋白间的相互作用。即酵母双杂交系统结果表明Org35蛋白的PAS结构域和NifA蛋白的N端区域介导了蛋白间的相互作用。 对org35进一步的功能研究中，构建了S35克隆PAS区域缺失和35PAS区域缺失插入壮观霉素抗性片段的同源重组突变体，研究了PAS缺失插入双交换突变体的的趋能性，环境因子(铵和氧)对其固氮活性的影响作用和对nifH，nifA基因的表达调控作用；并分析探讨了Org35蛋白辅因子的结合情况和org35基因的启动子区域。实验结果表明Org35蛋白对nifH，nifA基因的表达有调控作用，org35突变体并没有解除铵和氧的抑制作用，但其固氮酶活性和nifH的表达量均较野生型高，推测它可能作为一种负调控蛋白作用NifA蛋白而影响固氮作用。 同时，本研究构建了S64克隆的PAS区域完全缺失插入抗性片段的突变体，并初步探讨了其对环境因子(主要是铵和氧)的感应和传导作用。本研究内容为进一步揭示NifA蛋白在固氮调控中的作用机制奠定了基础。

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