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抗胆碱酯酶剂亚致死剂量对棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)乙酰胆碱酯酶诱导作用的研究

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第一章文献综述

第一节乙酰胆碱酯酶研究概况

1胆碱酯酶及AChE的研究历史

2 AChE的组织分布

3 AChE催化部位及晶体结构

4 AChE的抑制剂

5 AChE的分子型

6 AChE的基因结构

第二节乙酰胆碱酯酶与昆虫抗药性的关系

1乙酰胆碱酯酶量变和害虫抗药性的关系

2乙酰胆碱酯酶敏感度改变和害虫抗药性的关系

第三节杀虫药剂亚致死剂量对昆虫及其重要靶标酶影响的研究概述

1对昆虫行为的影响

2对昆虫生长发育和生殖力的影响

3对害虫抗性发展的影响

4杀虫药剂亚致死剂量对受试动物重要靶标酶的影响

5结语

第二章抗胆碱酯酶剂亚致死剂量对杀虫药剂毒力影响的研究

1材料与方法

1.1 供试昆虫

1.2供试药剂

1.3试剂及仪器

1.4生物测定方法

2结果与分析

2.1 棉铃虫3龄幼虫不同日龄对杀虫药剂敏感度的比较

2.2抗胆碱酯酶剂亚致死剂量对棉铃虫耐药性的影响

3 讨论

第三章抗胆碱酯酶剂亚致死剂量对棉铃虫ACHE诱导的时间和剂量效应

第一节抗胆碱酯酶剂亚致死剂量对棉铃虫诱导的时间效应

1材料与方法

2结果与分析

3 讨论

第二节抗胆碱酯酶剂亚致死剂量对棉铃虫诱导的剂量效应

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第三节抗胆碱酯酶剂亚致死剂量诱导棉铃虫不同世代生化指标的比较

1材料与方法

2结果与分析

3 讨论

第四章抗胆碱酯酶剂亚致死剂量对棉铃虫ACHE诱导的分子机制研究

第一节棉铃虫敏感品系(SS-H,SS-N)和阳谷种群(RR-Y)的生物测定及生化指标

1材料与方法

2结果与分析

3 讨论

第二节棉铃虫ACHE基因的克隆与序列分析

1实验材料和试剂

2 实验方法

3结果与分析

4讨论

第三节SOUTHERN杂交

1实验料和试剂

2实验方法

3结果与分析

4讨论

第五章抗胆碱酯酶剂亚致死剂量对棉铃虫ACHE不同分子型的影响

1材料与方法

1.1 供试昆虫

1.2供试药剂

1 3试剂及仪器

1.4 AChE活性及对抑制剂敏感度的测定

1.5 AChE蔗糖密度梯度离心

1.6蛋白质含量测定

2结果与分析

2.1 棉铃虫对照及处理组AChE蔗糖密度梯度离心

2.2 棉铃虫对照及处理组AChE不同分子型对抑制剂敏感度的比较

3 讨论

第六章棉铃虫ACHE分离纯化的初步研究

1材料与方法

1.1供试昆虫

1.2化学试剂

1 3试剂配制

1.4 主要仪器

1.5层析柱装柱、上样及洗脱方法

1.6 AChE纯化方法

1.7 AChE活性测定方法

1.8 蛋白质含量测定

2结果与分析

2.1 棉铃虫AChE的Sephadex G-25凝胶层析分离纯化

2.2棉铃虫AChE的Sephadex G-200凝胶层析分离纯化

2.3棉铃虫AChE的CEA亲和层析分离纯化

2.4棉铃虫AChE分离纯化结果

3 讨论

第七章总结

第一节总结与展望

第二节本研究的创新之处

参考文献

致谢

作者简历

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摘要

该文以棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)敏感品系(SS-H)为对象,系统研究了抗胆碱脂酶剂亚致死剂量对乙酰胆碱酯酶(AChE)的诱导作用,并对棉铃虫AChE进行了部分纯化,初步研究了棉铃虫对杀虫药剂耐性的分子机制.具体结果如下:1.选用3种抗胆碱酯酶剂亚致死剂量(LD<,10>)处理棉铃虫3龄幼虫24h后,测定存活幼虫对辛硫磷、马拉硫磷、灭多威、溴氰菊酯和高效氯氰菊酯5种杀虫药剂敏感度的变化.结果显示不同抗胆碱酯酶的诱导作用不同,导致棉铃虫对不同杀虫药剂敏感度的变化存在差异.2.辛硫磷亚致死剂量(LD<,10>)诱导棉铃虫144h内,AChE活性下降,对底物(ATCh)的亲和力在其诱导的48h内无明显变化.马拉硫磷和灭多威LD<,10>剂量诱导对棉铃虫AChE活性诱导增加效应较为明显,但48h内对底物的亲和力却明显降低.在对照组K<,m>值明显升高的72~120h内,3个处理组K<,m>值同本组其他时间段K<,m>值相比无明显变化.3.辛硫磷不同剂量对棉铃虫幼虫AChE比活力存在一定的抑制作用;马拉硫磷和灭多威对AChE的诱导则是随着剂量的增加,存在先抑制后诱导增加的作用.相同剂量下,灭多威的诱导增加效应较马拉硫磷明显.4.辛硫磷LD<,10>剂量连续诱导棉铃虫4代,对AChE比活力和V<,max>作用表现为先抑制后诱导增加,但变化幅度较小.马拉硫磷和灭多威LD<,10>剂量诱导棉铃虫幼虫两代后,对乙酰胆碱酯酶的诱导作用不明显.长期诱导过程中,三种药剂LD<,10>剂量均明显影响昆虫生长发育.5.比较研究了棉铃虫两个敏感品系(SS-N和SS-H)和一个抗性种群(山东阳谷,RR-Y)对3种抗胆碱酯酶剂的耐药性,同SS-N品系相比,RR-Y对辛硫磷、马拉硫磷和灭多威的抗性分别为7,13和20倍.同SS-H品系相比,SS-N品系对三种药剂更敏感.动力学研究表明棉铃虫3个品系AChE的比活力和V<,max>没有显著差异,而AChE对底物ATCh的亲和力(K<,m>)RR-Y却显著低于敏感品系.采用RT-PCR技术从棉铃虫成虫头部克隆了AChE基因片段并制备探针进行Southern杂交,证明在有机磷和氨基甲酸酯抗性棉铃虫中不存在乙酰胆碱酯酶基因的扩增.对抗胆碱酯酶剂亚致死剂量各处理组AChE Southern杂交表明,在亚致死剂量处理后,对AChE活性的诱导作用不是由于乙酰胆碱酯酶基因的扩增.6.抗胆碱酯酶剂亚致死剂量处理24h后,对棉铃虫AChE的密度梯度心结果显示,处理前后AChE活性分布的变化在各梯度层差异显著,可能是由于抗胆碱酯酶剂亚致死剂量处理使棉铃虫AChE分子型的亚基结合发生改变造成的.棉铃虫对照及处理组AChE不同分子型敏感度的研究表明,对毒扁豆碱及灭多威抑制均相对敏感的5.3S AChE和只对毒扁豆碱的抑制相对敏感的8.7S AChE,处理后其I<,50>值与对照相比明显升高,预示抗胆碱酯酶剂亚致死剂量引起的AChE活性和对底物亲和力的改变,可能是某些分子型分布比例及其对抑制剂敏感的AChE分子型敏感度发生改变的综合效应.7.采用CEA亲和层析法对棉铃虫AChE进行分离纯化,通过Sephadex G-25、Sephadex G-200凝胶层析及CEA亲和层析,得到纯化倍数为206倍的棉铃虫AChE,纯化效率为30%.

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