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表达IBDV--VP2新型重组乳酸菌的构建及其免疫效果的评价

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摘要

乳酸菌(Lactic Acid Bacteria，LAB)是一类以乳酸为主要代谢产物的厌氧菌。早在几百年前，人们就利用乳酸菌生产酸奶等发酵食品，其安全特性已经被广泛认可。近年来，乳酸菌作为重组蛋白口服载体疫苗的潜力也备受关注。在过去的二十年中，许多乳酸菌菌株的生理学和遗传学特性已经被彻底地研究，一些菌株已经完成全基因组测序，并且开发出了多种基于乳酸乳球菌的遗传表达工具，其中NICE基因调控表达系统(Nisin-controlled gene expression system，NICE)就是一种简便、可控的表达系统，该系统通过纳克量级的nisin（来自乳酸菌自身的一种34个氨基酸的天然细菌素）即可激活并诱导目的基因的转录和表达，因此，该系统已被广泛应用于表达外源蛋白;此外，乳酸菌还有非诱导的组成型持续表达系统等。但是与相对成熟的酵母和大肠杆菌表达系统相比，乳酸菌表达系统普遍存在表达量不足、难以分泌等劣势，不利于重组乳酸菌的构建和外源目的蛋白的表达。本研究独创性地采用由NICE诱导表达系统和组成型持续表达系统组成的双启动子串联表达策略，构建了由单一质粒携带双启动子串联表达同一目的蛋白的新型重组乳酸菌，旨在弥补乳酸菌表达系统表达量不足的问题;并且在目的蛋白VP2羧基端融合了肠炎沙门氏菌侵袭蛋白RCK的黏附功能域多肽，旨在利用该蛋白多肽黏附入侵细胞的特性，增加抗原递呈细胞对目的蛋白的被动摄取，从而引起更强的免疫应答，弥补乳酸菌作为口服疫苗载体不能有效递送抗原的问题。 本研究利用食品级乳酸乳球菌NZ3900作为宿主菌株，并在其配套的食品级NICE表达质粒pNZ8149的基础上，引入了由P45启动子组成的乳酸菌持续表达单元，构建了由单一质粒携带双启动子的串联表达载体，同时融合表达了传染性法氏囊病主要抗原蛋白VP2和沙门氏菌侵袭蛋白RCK的黏附功能域，成功构建了r-L，Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK重组乳酸菌;此外，还引入了pgsA跨膜蛋白的锚定结构域（用于外源蛋白的表面展示），成功构建了锚定展示重组乳酸菌r-L.Lactis-pgsA-VP2-RCK。 体外检测结果显示:重组乳酸菌r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-R CK成功表达了52kD大小的融合蛋白，与预期结果一致，且融合蛋白表达量可达160μg/mL。重组乳酸菌r-L.Lactis-pgsA-VP2-RCK成功表达了95kD大小的融合蛋白，与预期结果吻合，并且经表面蛋白提取、间接免疫荧光和流式细胞分析证明了融合蛋白部分表达并展示于细胞表面。 动物实验结果显示:口服109CFU重组乳酸菌r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK，一免一周和二免一周后，血清IBDV-ELISA抗体(IDEXX全病毒包被ELISA及VP2包被ELISA)全部为阴性，中和抗体滴度为0;攻毒1000个ELD50的IBDV-HLJ0504超强毒之后，仅有60％的免疫鸡存活，存活鸡的法氏囊有不同程度的损伤。注射109CFU重组乳酸菌r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK，一免一周和一免两周后，血清IBDV-ELISA抗体也全部为阴性，但中和抗体滴度在一免一周和一免两周后分别可以达到26和28;攻毒1000个ELD50的IBDV-HLJ0504超强毒之后，免疫鸡100％存活，且法氏囊基本不受损害。口服109CFU重组乳酸菌r-L.Lactis-pgsA-VP2-RCK，一免一周和二免一周后，血清IBDV-ELISA抗体全部为阴性，中和抗体滴度为0;一免两周后攻毒1000个ELD50的IBDV-HLJ0504超强毒，该实验组的免疫攻毒保护率仅为50％，且存活鸡法氏囊损伤严重。 本研究构建的由单一质粒携带双启动子串联表达同一目的蛋白的新型重组乳酸菌，能够同时由双启动子串联表达VP2-RCK融合蛋白，表达量可达到160mg/L以上。动物实验结果说明:注射r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK重组乳酸菌可引起机体产生有效的免疫应答，仅一次免疫即可产生高水平的中和抗体，能够抵抗IBDV超强毒的攻击，产生100％的保护率。双启动子串联表达同一目的蛋白的新型重组乳酸菌为重组乳酸菌活载体疫苗的开发和应用奠定了基础，为新型黏膜疫苗的研究提供了全新的工具。

著录项

  • 作者

    王文骞;

  • 作者单位

    中国农业科学院;

  • 授予单位 中国农业科学院;
  • 学科 兽医
  • 授予学位 硕士
  • 导师姓名 崔红玉;
  • 年度 2019
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类
  • 关键词

    表达; 重组; 乳酸菌; 构建;

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