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【6h】

中温淀粉酶的热稳定性及水解活性改良研究

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摘要

α-淀粉酶是一类水解淀粉α-1，4糖苷键从而将其水解为糊精、低聚糖和单糖的酶。随着应用需求的增加及生物技术的愈加成熟，提高其稳定性及水解活力具有重要的意义。本论文以目前用于工业生产的来源于Cytophaga sp.和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的淀粉酶基因CamyA和BamyA为材料，成功实现了在枯草芽孢杆菌中的异源表达，通过理性设计有效提高其热稳定性和水解活性，同时通过动力学模拟探究了淀粉酶CamyA热稳定性及水解活力提高的机制。 枯草芽孢杆菌表达的淀粉酶CAMYA最适温度为55℃，最适pH为7.0，70℃下处理5min后剩余酶活为26％，在pH1.0-6.0条件下不稳定。以可溶性淀粉为底物时，比活为5，550U·mg-1。对其动力学常数进行了测定，Km为3.19mg·mL-1，Vmax为6，534μmol·min-1·mg-1。通过不同性质淀粉酶的序列及结构分析，设计突变体CAMYA-△R178/△G179和CAMYA-S33A/S34E/V35H。突变体△R178/△G179在70℃下处理5min后剩余酶活为70％;80℃处理5min后，△R178/△G179和野生型剩余酶活分别为28％和8％。而突变体S33A/S34E/V35H表现更高的催化活性，比活较野生型提高1倍（10,725U·mg-1vs.5，550U·mg-1），催化效率提高2.3倍。两者组合后得到S33A/S34E/V35H/△R178/△G179，在70℃和80℃下处理5min后剩余酶活分别为90％和40％，比活为15，594U·mg-1，是野生型的2.8倍。模拟轨迹显示，删除R178和G179这两个氨基酸后Loop区变短，淀粉酶结合Ca2+能力增强，从而热稳定性提高。突变后使得淀粉酶由Ca2+依赖型转变为非Ca2+依赖型，可能由于Ca2+结合力增强后，结合的Ca2+不容易丢失，从而在后面的反应中不需要再额外添加。突变位点S33A/S34E/V35H处于淀粉酶的N端结构域，突变后Km值明显降低，推测该部分突变使酶与底物亲和能力增强，从而提高催化活力。用15L发酵罐进行90h发酵后，组合突变体酶活为355，800U·mL-1，蛋白量为23mg·mL-1。 为验证S33A/S34E/V35H位点突变效果的普适性，我们选取了目前工业广泛应用的来源于解淀粉芽孢杆菌的淀粉酶BAMYA在同样位点进行突变，设计突变体S61A/D62E/163H，在芽孢杆菌中进行表达后重组酶的比活为10，744U·mg-1，比野生型提高57％（6，835U·mg-1）。野生型BAMYA和突变体BAMYA-S61A/D62E/I63H的Km值、Vmax及催化效率分别为3.58mg·mL-1和2.97mg·mL-1,6,534μmol·min-1·mg-1、16,628μmol·min-1·mg-1以及1,577mL·s-1·mg-1和3,042mL·s-1·mg-1。另外通过与高比活的序列和结构分析发现，BAMYA的C端位点473-475位的LKN位点可能与酶的催化相关，设计突变位点L473K/K474H/N475K，表达后比活为10，148U·mg-1，比野生型提高48％。Km值、催化效率分别为2.21mg·mL-1和4，760mL·s-1·mg-1。但上述二者的组合突变效果不明显。 本研究利用定点突变的方法，有效提高了目前工业应用的淀粉酶的热稳定性和催化活性，获得的突变体应用于工业生产可有效提高其水解效率，同时为淀粉酶突变研究提供参考。

著录项

  • 作者

    邱锦;

  • 作者单位

    中国农业科学院;

  • 授予单位 中国农业科学院;
  • 学科 生物化学与分子生物学
  • 授予学位 硕士
  • 导师姓名 姚斌;
  • 年度 2019
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 其他化学工业;
  • 关键词

    中温淀粉酶; 热稳定性; 水解活性;

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