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水稻呼吸相关代谢产物的亲水作用色谱-串联质谱测定方法研究

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摘要

随着代谢组学的兴起,人们越来越关注和重视对低分子量代谢产物的分析。已有研究表明,作为遗传信息终产物的低分子量代谢产物,尤其是一些极性代谢产物在生物体内起到关键作用。呼吸在植物体的整个代谢网络中处于枢纽地位,其代谢途径多样,具体过程十分复杂。呼吸作用主要包括糖酵解、戊糖磷酸途径和三羧酸循环,代谢产物如磷酸糖、有机酸、腺苷、还原型辅酶等化合物在植物体内具有重要的生理作用,通过分析相关代谢产物可以更加全面认识植物呼吸。
　　 呼吸相关代谢产物极性强、亲水性强、化学结构相似,不能被反相色谱柱保留。目前,常采用的方法有阴离子交换色谱法、反相离子对色谱法等,尽管这些方法在一定程度上也能够取得良好的分离效果,但这些分离模式与质谱检测器(MS)的兼容性差,且受灵敏度低等因素的限制。此外,现有的方法能检测的样品基质多为细菌、酵母、培养细胞等简单基质,对复杂生物系统如植物研究的较少；且大多只能检测样品中几种或某一类化合物,缺乏针对复杂基质条件下呼吸相关代谢产物的比较全面、有效的检测方法。
　　 亲水作用色谱(hydrophilic interaction chromatography,HILIC),是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术,且与质谱的兼容性好。本论文采用新型亲水作用色谱技术(HILIC),以聚合氨基柱Shodex Asahipak NH2P-504E为固定相,结合高灵敏、高选择性的串联质谱检测器,建立了一种高通量的HILIC-MS／MS分析方法,可对水稻中的29种呼吸相关代谢产物同时进行准确定性定量分析。通过本实验方法的建立,取得了如下主要研究成果:
　　 1.确定了最佳质谱条件
　　 通过一级质谱全扫描,得到每个目标代谢物的准分子离子峰,并分别比较各目标物在正离子扫描与负离子扫描两种扫描模式下,准分子离子峰的响应强度,确定了羧酸类、磷酸糖、及AMP、ADP、ATP、cGMP、GTP等腺苷类化合物选择负离子模式监测,而NAD+、NADH、NADP、NADPH、FAD、乙酰辅酶A、琥珀酰辅酶A等化合物选择正离子模式监测；再进行二级质谱扫描得出每个目标代谢物的特征子离子,并在选择反应监测模式(SRM)下进行准确定性定量分析。
　　 2.选择了适用于呼吸相关代谢产物的色谱柱
　　 通过对两性键合固定相ZIC-HILIC色谱柱与聚合氨基色谱柱Shodex Asahipak NH2P-504E的比较研究,明确了目标代谢物质在聚合氨基液相色谱柱上具有更好的保留行为,分离效果更好。
　　 3.明确了pH、缓冲盐的种类及浓度等色谱条件对目标代谢物分离的影响
　　 通过流动相pH与缓冲盐试验,发现pH值与缓冲盐是影响目标化合物保留的两个至关重要的因素。其表现的具体规律是:随着pH值与缓冲盐浓度的增大,流动相洗脱能力增强,出峰的化合物个数增加,灵敏度提高,峰形改善；0～20mM范围的甲酸铵、乙酸铵,均无法解决柠檬酸与异柠檬酸的拖尾以及含多个磷酸根化合物难洗脱的问题,15mM的碳酸铵或碳酸氢铵可确保所有目标化合物出峰,并成功解决了拖尾、吸附难题；碳酸铵与碳酸氢铵的作用无明显差异；缓冲盐浓度与pH的最佳组合为碳酸铵浓度15mM,pH10.3。
　　 4.确定了提取水稻样品中呼吸代谢产物的最佳条件
　　 在水稻样品的提取中,考察了沸水、80％乙腈、(750:200:50,v／v／v)乙腈／水／甲酸、(3:7,v／v)氯仿／乙腈+水等不同提取液的提取效率。结果表明,(3:7,v／v)氯仿／乙腈+水的提取最好:在选择提取方式时,考察了超声提取和振荡提取对提取效率的影响,得出振荡提取方法更为有效。
　　 5.建立了水稻样品中呼吸相关代谢产物的测定方法
　　 确定了标准曲线和线性范围、检测限、加标回收率和精密度等方法学参数。29种呼吸相关代谢产物在0.01～10mg／kg质量浓度范围内线性相关系数(R2)均大于0.99,方法的检测限分别为0.001～0.25mg／kg；相对标准偏差(RSD)小于20％,加标回收率为63.3～133.5％。
　　 6.用已建立的提取方法与HILIC-MS／MS分析方法测定了水稻样品(珍汕97B)叶部与根部的29种呼吸相关代谢产物,并采用标准加入法进行定量分析。检测结果为珍汕97B的叶部测出22种目标化合物,根部测出8种目标化合物。
　　 本研究建立的HILIC-MS／MS分析方法具有高灵敏度、高通量、定性定量准确的特点,适用于植物样品中呼吸代谢产物的定量和确证分析。

著录项

  • 作者

    刘慧;

  • 作者单位

    中国农业科学院;

  • 授予单位 中国农业科学院;
  • 学科 农产品质量与食物安全
  • 授予学位 硕士
  • 导师姓名 陈铭学;
  • 年度 2011
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 稻;
  • 关键词

    亲水作用色谱; 串联质谱; 代谢产物; 水稻呼吸;

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