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表达高致病性猪蓝耳病病毒(HuN4株)GP5重组伪狂犬病毒的构建及鉴定

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第一章绪论

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1.1.1猪繁殖与呼吸综合征病原

1.1.2猪繁殖与呼吸综合征病毒的特征

1.1.3猪繁殖与呼吸综合征病毒的蛋白功能

1.2高致病性猪蓝耳病的概述及相关疫苗的研究

1.2.1我国经典PRRS毒株的分离和鉴定

1.2.2 CH-1a株的致病力

1.2.3高致病性猪蓝耳病的爆发和特征

1.2.4猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究

1.2.5高致病性蓝耳病的疫苗研究

1.3重组伪狂犬病毒的研究进展

1.4本研究的目的

第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株GP5蛋白的遗传变异分析

2.1材料与方法

2.1.1毒株

2.1.2 GP5蛋白的进化树分析

2.1.3 GP5蛋白的关键氨基酸序列分析

2.1.4 HuN4株在传代过程中的序列保守性

2.2结果

2.2.1不同PRRS毒株的GP5进化树分析

2.2.2不同毒株GP5蛋白的同源性分析

2.2.3我国大陆分离株与疫苗株的关系

2.2.4发生变异的关键氨基酸

2.2.5 HuN4株在传代过程中的序列保守性

2.3讨论

第三章表达HPPRRSV HuN4株GP5重组伪狂犬病毒的构建和鉴定

3.1材料与方法

3.1.1毒株、细胞、菌种、载体

3.1.2主要试剂和药品

3.1.3主要溶液的配置

3.1.4引物设计

3.1.5转移载体的构建

3.1.6转染的准备

3.1.7瞬时转染

3.1.8稳定转染

3.1.9重组病毒的筛选和纯化

3.1.10重组病毒的鉴定

3.2试验结果

3.2.1转移载体的鉴定

3.2.2瞬时转染EGFP的表达情况

3.2.3重组病毒的筛选及鉴定

3.3讨论

第四章全文结论

参考文献

致 谢

作者简历

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摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)也称猪蓝耳病,是由动脉炎病毒科动脉炎病毒属的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)引起的一种严重的病毒性传染病,该病以引起母猪的繁殖障碍、仔猪和育成猪呼吸道症状及高死亡率为主要特征。自1987年首次发现以来,该病广泛流行于世界各主要养猪国家和地区,已成为威胁养猪业的主要疫病之一。2006年以来,由该病毒变异株引起的高致病性猪蓝耳病(Highlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndrome,HPPRRS)在我国广泛流行给养猪业带来了巨大的损失。包括灭活苗和弱毒苗在内的传统PRRS疫苗对HPPRRS只能起到部分保护作用,因此研制针对HPPRRS的高效的疫苗显得极为迫切。本实验室在研制HPPRRS常规疫苗的同时,也开展了利用基因工程技术构建表达HPPRRS病毒GP5的重组活载体疫苗,发挥此类疫苗多价并且可以作鉴别诊断的优点,探索基因工程疫苗作为HPPRRS常规疫苗的补充,为防治HPPRRS的生物制品提供更多的选择。 GP5蛋白是PRRSV的主要囊膜糖蛋白,也是PRRSV重要的中和抗原,用含GP5基因的质粒DNA进行免疫,接种的猪产生了抗PRRSV的中和抗体,并可使接种猪在强毒攻击后得到有效保护。GP5基因在不同PRRSV毒株之间遗传变异较大。为了更清晰地了解PRRSV的遗传变异特征,本研究选取了PRRRSV的代表毒株和国内高致病性猪蓝耳病的代表株、及标准毒株HuN4株及其传代毒的GP5序列进行同源性分析及氨基酸序列比对。结果表明:本文分析的我国分离株为北美洲型,且与2006年后我国分离的其它高致病性猪蓝耳病病毒GP5间存在较高的同源性,而与国内经典的流行毒株差异较大,且存在关键氨基酸的突变和一些规律性的点突变。本实验室已经构建的以伪狂犬病毒Bartha-K61株为载体表达PRRSVCH-1a株的GP5重组病毒,免疫猪后可以有效的抵抗PRRSVCH-1a株强毒的攻击。但由于HPPRRS病毒的GP5与PKRSVCH-1a株GP5氨基酸的同源性只有93%,影响了该重组病毒对HPPRRS的保护效果。因此,本研究通过构建表达HPPRRS病毒HuN4株GP5的重组伪狂犬病毒,为将来探讨其是否能够成为有效防制HPPRRS的疫苗奠定基础。 本研究以经典的伪狂犬弱毒疫苗Bartha-K61株为载体,构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为选择标记的表达HPPRRS病毒HuN4株GP5的重组伪狂犬病毒。构建了含HPPRRS病毒GP5基因和EGFP报告基因的PRV转移载体,经酶切、PCR鉴定后为阳性的质粒命名为pgG-HPGP5-EGFP。将该质粒纯化后,采用LipofectaminTM2000瞬时转染293T细胞,转染后48h后EGFP表达效率最高。利用磷酸钙转染方法将质粒DNA和PRVBartha-k61株的基因组共转染Vero细胞,转染后60~72h观察细胞病变,将带有绿色荧光病变的转染产物收获,从F2代开始采用蚀斑克隆的方法纯化重组病毒,经6轮蚀斑纯化,获得了稳定表达EGFP的重组病毒,我们将得到的重组病毒命名为rPRV-HPGP5。对第8代重组病毒进行PCR、Westernblot和IFA鉴定。PCR扩增到了GP5基因并且重组病毒仍为gE缺失株,通过IFA和Westernblot鉴定证实HPPRRS病毒HuN4株GP5基因得到了有效表达。

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