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自人体脂肪组织分离与培养间充质干细胞及磷脂酰胆碱对体外培养的人脂肪细胞作用的实验研究

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第一章自人体脂肪组织分离与培养间充质干细胞的实验研究

第二章磷脂酰胆碱对体外培养的人脂肪细胞作用研究

综述

中英文缩略词对照表

攻读学位期间的成果

致谢

第一军医大学学位论文原创性声明及学位论文版权使用授权书

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摘要

一、自人体脂肪组织分离与培养间充质干细胞的实验研究 研究背景：种子细胞是组织工程化组织能够再生的首要物质基础。干细胞由于其体外高增殖率和多向分化潜能成为种子细胞研究的热点。近年来，研究显示脂肪基质细胞中存在着一定量的干细胞(称为脂肪组织来源的间充质干细胞，AMSCs)，在一定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞及神经细胞方向分化。虽然对AMSCs的初步研究有一定的成果，但是其中仍有许多问题有待阐明。如脂肪组织中是否真正存在一类干细胞，这类干细胞是否是周围血中MSCs透过血液向脂肪组织中的渗透。如何在体外构建一种简单、经济、易推广的培养方法。分化后的细胞是否来源AMSCs，以及AMSCs的免疫性如何等都是有待探讨的地方。 目的：探索人脂肪组织源性间充质干细胞(AMSCs)的分离、体外培养方法，以及生物学特性，为其广泛应用提供实验依据。 方法：无菌条件下获取腹部手术病人皮下脂肪组织，酶消化法分离、培养AMSCs，观察细胞形态并绘制细胞生长曲线，计算细胞群体倍增时间。对第2代细胞进行免疫组织化学染色，鉴定其表面分子CD44表达。取2～4代细胞用含体积分数为10％胎牛血清，1％青链霉素原液，1μmol/L地塞米松，10μmol/L胰岛素，0.5mmol/LIBMX的高糖DMEM培养基中诱导培养两周，观察细胞形态变化，并用油红“O”染色定性。 结果：人脂肪组织中含有大量间充质干细胞，接种后细胞在24小时内贴壁，初为小圆形，2～4天可见细胞伸展，大多数细胞为长梭形，呈成纤维细胞样贴壁生长，其间也可见形态、体积不一的多种细胞成分。此后细胞增殖旺盛，原代培养的细胞7～10天即达70％～80％融合，可进行常规传代培养，传代后细胞形态无大变化，体外培养10代以后，细胞的增殖速度无明显减慢。细胞群体倍增时间为55小时左右。免疫化学染色鉴定70％的培养细胞呈CD44阳性。加入成脂诱导培养基诱导培养2～4天后，培养皿中就出现含有空泡的脂肪细胞，1周后达高峰，同时细胞中小脂滴开始融合，形成大的脂滴，并开始向外界分泌，油红”O”染色后细胞内出现大量红染颗粒，证明细胞内颗粒确为脂滴。 结论：1、本实验用酶消化法成功的从人体脂肪组织中培养出脂肪间充质干细胞，培养方法比较经济、简便，容易推广。2、用免疫组化染色对培养出的细胞进行表面标志CD44分子的鉴定，结果显示70％的培养细胞阳性表达CD44分子，表明在人体脂肪组织中含有可为组织修复所利用的间充质干细胞，但细胞成分并不纯。3、用含有胰岛素、地塞米松及异丁基甲基黄嘌呤的成脂培养基成功诱导脂肪间充质干细胞分化成为成熟的脂肪细胞，诱导作用明显，方法简便。 二、磷脂酰胆碱对体外培养的人脂肪细胞作用研究 研究背景：近年来，可注射性磷脂酰胆碱合剂被用于注射溶脂领域，即在需要减肥的部位皮下注射一种磷脂酰胆碱合剂以达到溶解脂肪的效果。此种方法由于简单、易行，病人不用承受痛苦，不用造成新的创伤等优点而有着广阔的应用前景。但对磷脂酰胆碱是否能溶解脂肪组织、对于人体是否有副作用以及溶解脂肪后的转归都有待探讨。国内外均缺乏相关的基础研究。 目的：探索磷脂酰胆碱对体外培养的人脂肪间充质干细胞(AMSCs)向成熟脂肪细胞分化时细胞内脂肪积聚，以及对成熟脂肪细胞活性的作用。探讨其作为皮下注射溶脂药物的可能性。 方法：体外培养人皮下脂肪组织的脂肪干细胞，在其成脂培养基中分别加入不同浓度(0、0.05％、0.5％、5％)的磷脂酰胆碱，油红“O”染色提取法测定细胞内脂肪含量，在酶标仪上测定OD值，运用SPSS10.0软件包进行统计学分析。用不同浓度(0、0.05％、0.5％、5％)的磷脂酰胆碱干预成熟脂肪细胞生长，分别在干预3天、5天、7天后用吖啶橙(AO)/溴化乙啶(EB)染色观察细胞活性情况。 结果：磷脂酰胆碱可明显抑制脂肪干细胞向成熟脂肪细胞分化时胞内脂肪积聚，统计学结果显示，时间相同时各浓度之间OD值与空白对照组比较均有显著性意义(P＜0.05)，浓度相同时，随着时间变化，各时间组OD值之间均有显著性差异(P＜0.05)；AO/EB染色：空白对照组的核染色显示明亮的绿色荧光，显示细胞活性良好。和同时间的空白对照组比较，0.05％浓度的磷脂酰胆碱对成熟脂肪细胞作用3天后表现为诱导凋亡作用，核黄绿色，呈固缩状。0.5％浓度在作用3天、5天、7天后细胞均表现为坏死状态，核呈橘红色荧光。5％浓度对细胞破坏最为严重，作用5天时细胞开始完全坏死，出现细胞溶解，作用7天时几乎看不到细胞结构。 结论：1、磷脂酰胆碱对脂肪干细胞分化过程中脂肪积聚呈抑制作用。时间相同时，浓度越高，这种抑制作用越明显，浓度相同时，时间越长，抑制作用越明显。其中5％浓度组对脂肪细胞的破坏作用最显著。2、通过AO/EB染色证实了低浓度的磷脂酰胆碱对成熟脂肪细胞有诱导调亡作用，而高浓度对成熟脂肪细胞有破坏作用。作用机理可能与其破坏细胞膜有关。

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