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尿液水通道蛋白-2间接ELISA法的建立及几种药物对肾脏和尿液水通道蛋白-2的影响

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结果

一,间接酶联免疫吸附法定量检测大鼠尿液水通道蛋白2浓度

二,卡托普利与洛沙坦对肾脏及尿液水通道蛋白-2的影响

三,几种中草药对肾脏及尿液AQP2的影响

附图

讨论

结论

参考文献

肾脏水通道蛋白-2的表达和调控

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摘要

目的：水通道蛋白-2(AQP2)是迄今为止发现的最具病理生理意义的水通道蛋白之一，对维持机体水平衡和调节体液容量至为重要。AQP2主要分布在肾脏集合管主细胞胞浆内和管腔侧细胞膜上，在机体内主要受抗利尿激素(血管加压素，AVP)经血管加压素2型受体(V2R)调节。其中部分肾脏AQP2蛋白可脱落于肾小管腔内而被尿液冲出，尿液AQP2是反映AVP作用的内在生物学指标。我们在以前工作的基础上，试图建立稳定的定量检测尿液AQP2的酶联免疫吸附测定(ELISA)法，并观察了正常大鼠不同水代谢状态下尿液AQP2的变化规律。在许多伴有水代谢失衡的疾病中，如充血性心力衰竭、肝硬化、肾病综合症等，AQP2往往表达异常，因此寻找一些能干预AQP2表达的药物就成了一个非常重要的课题。卡托普利及洛沙坦作为阻断肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensinsystem，RAS)的药物，在临床上被广泛应用，尤其在充血性心力衰竭的治疗中取得显著的疗效。本实验就正常生理情况下，卡托普利及洛沙坦对大鼠肾脏和尿液中AQP2的改变进行了研究。另外，中药是我国一个宝贵资源，我们根据已有的中药的相关信息，选取几味中草药，检测药物对肾脏及尿液AQP2的影响，试图筛选出一至两种能干预AQP2表达的中药或者单体。 方法：人工合成AQP2蛋白C末端的CELHSPQSLPRGSKA多肽片段，并与牛血清白蛋白偶联作为标准品，将AQP2多肽与钥孔血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin，KLH)相连后免疫家兔，获得兔抗鼠AQP2多克隆抗体。所有大鼠均单独饲养在代谢笼中，自由进食，收集尿液。实验一，为建立间接ELISA法检测尿液AQP2方法，我们研究了不同浓度SDS对检测结果的影响、间接ELISA变异率、灵敏度以及大鼠正常、禁水24小时、以及水负荷状态(80ml/kg)下的尿液AQP2排泄率的变化。实验二，对正常大鼠分别应用卡托普利(10mg/d·kg)和洛沙坦(10mg/d·kg)，经胃灌入，大鼠自由进水，连续收集尿液，记录尿量，用间接ELISA检测尿液AQP2的变化、对用药后1天和7天的大鼠肾内髓质分别用RT-PCR和免疫印迹法(Westernblotting)检测V2R、AQP2mRNA和AQP2蛋白。实验三，从中药中选取黄芪、泽泻、猪苓三种药物；剂量：1.2g·kg-1·d-1原生药，连续灌胃7天，大鼠自由进水，收集尿液，检测尿液AQP2的变化，对改变尿液AQP2的药物进一步检测肾内髓质V2R及AQP2mRNA和AQP2蛋白。 结果：一，SDS预处理尿液是ELISA成功检测尿液AQP2的重要因素，可提高检测水平，用0.05％SDS-PBS倍比稀释大鼠尿液最为合适。 二，本方法批内差异系数6.5％，批间差异系数7％，灵敏度为112.5fmol/ml;禁水24后大鼠尿液AQP2/肌酐显著增加(P＜0.01)，给予水负荷后尿液AQP2/肌酐显著降低(P＜0.01)；且尿渗量与尿液AQP2/肌酐呈正相关(r=0.526，P＜0.001)。 三，卡托普利、洛沙坦对正常大鼠血钠、尿量、尿渗量、尿AQP2的影响卡托普利组、洛沙坦组与对照组相比，血钠无显著差异。用药后，卡托普利组与洛沙坦组尿量均增加(P＜0.05)；卡托普利组用药前、用药后1天、7天尿量分别是9.9±5.7ml、14±9.0ml、17.3±6.7ml；洛沙坦组用药前、用药后1天、7天尿量分别为8.4±6.0ml、7.5±4.4ml、17±4.5ml。洛沙坦组用药前后尿渗量、尿AQP2浓度无显著差异。用药后，卡托普利组尿渗量降低(P＜0.05)，用药前、用药后1天、7天分别为1678±257.8mosm/kgH2O、1446.7±215.6mosm/kgH2O、1434±214.9mosm/kgH2O。用药后，卡托普利组尿AQP2浓度增加(P＜0.05)，用药前、用药后1天、7天分别为5.6±1.3ng/ml、9.2±1.7ng/ml、6.9±2.0ng/ml。 四，卡托普利、洛沙坦对正常大鼠肾内髓质中AQP2及V2RmRNA和AQP2蛋白的影响 卡托普利组、洛沙坦组V2RmRNA在用药后1天、7天与对照组相比无显著差异。洛沙坦组AQP2mRNA与AQP2蛋白在用药后1天、7天与对照组相比无显著差异。用药后1天、7天与对照组相比，卡托普利组AQP2mRNA分别减少了0.28、0.31(P＜0.05)，AQP2蛋白分别减少了0.32、0.25(P＜0.05)。卡托普利组AQP2mRNA和AQP2蛋白用药后1天与7天相比无显著差异。 五，应用黄芪、泽泻、猪苓对正常大鼠尿量及尿AQP2的影响用药前后黄芪组尿量无显著差异，泽泻组尿量有增加的趋势，由用药前的10.75±4.2ml增加到用药后7天14.25±3.8ml；猪苓组尿量增多(P＜0.05)，由用药前9.8±4.2ml增加到用药后7天15.8±6.2ml. 用药前后，黄芪及泽泻组尿液中AQP2浓度无差异，而猪苓组尿液中AQP2浓度显著降低(P＜0.01)，用药前为9.47±2.2ng/ml，用药后7天3.8±2.0ng/ml。相应地，猪苓组尿液AQP2的排泄率，即尿液AQP2/肌酐(fmol/umol)，由用药前的560±180fmol/umol降为用药后7天328±62fmol/umol(P=0.012)。 猪苓对正常大鼠肾内髓质的AQP2与V2RmRNA表达及AQP2蛋白无明显的影响。 结论：一，成功建立间接ELISA法检测尿液AQP2。SDS预处理尿液是必要的。本方法批内差异系数6.5％，批间差异系数7％，灵敏度为112.5fmol/ml。 二，卡托普利增加正常大鼠24h尿量，降低尿渗量，降低肾脏AQP2的表达，且促进AQP2经尿液的排泄。洛沙坦也增加正常大鼠正常大鼠24h尿量，对尿渗量、肾脏AQP2表达及尿液AQP2的排泄没有影响。两者对V2RmRNA的表达均没有影响。 三，初步研究显示，黄芪对正常大鼠24h尿量没有影响，泽泻与猪苓均可以增加正常大鼠24h尿量，猪苓还降低正常大鼠尿液AQP2的排泄，但猪苓对正常大鼠肾脏V2R及AQP2mRNA和AQP2蛋白的影响仍待更深入的研究。

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