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基于顺铂/酵母微囊的口服靶向递送系统在治疗肿瘤中的应用研究

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摘要

第一章 前言

第二章 酵母微囊的制备、表征及其负载性能的研究

2．1 酵母微囊的制备和表征

2．1．1 材料与方法

2．1．2 结果

2．1．3 讨论

2．2 酵母微囊负载性能的研究

2．2．1 材料与方法

2．2．2 结果

2．2．3 讨论

2．3 本章小结

第三章 顺铂／酵母微囊的口服靶向递送系统的制备、表征及其体外评价

3．1 顺铂／酵母微囊口服药物递送系统的制备和表征

3．1．1 材料与方法

3．1．2 结果

3．1．3 讨论

3．2 顺铂／酵母微囊口服药物递送系统的体外评价

3．2．1 材料与方法

3．2．2 结果

3．2．3 讨论

3．3 本章小结

第四章 顺铂／酵母微囊口服靶向递送系统的体内外抗肿瘤效应及其初步安全性评价

4．1 顺铂／酵母微囊口服靶向递送系统的体内外抗肿瘤效应

4．1．1 材料与方法

4．1．2 结果

4．1．3 讨论

4．2 顺铂／酵母微囊口服靶向递送系统初步安全性评价

4．2．1 材料与方法

4．2．2 结果

4．2．3 讨论

4．3 本章小结

全文结论

参考文献

文献综述 顺铂耐药性的分子机制

在读硕士期间发表论文

致谢

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摘要

顺铂(cis-diamminedichloroplatinum(Ⅱ)，CDDP)于1978年首次被美国食品药品管理局(Food and Drug Administration， FDA)批准用于治疗睾丸癌和膀胱癌，之后在临床上得到了广泛的应用，作为一种广谱抗肿瘤药物，顺铂发挥抗肿瘤作用的机制是通过与肿瘤细胞DNA形成复合物，干扰细胞的生长周期，进而导致细胞死亡或凋亡。在多种实体瘤的化疗过程中有显著的效果，包括乳腺癌、卵巢癌、肠癌、肺癌、脑癌等恶性肿瘤。通常情况，在顺铂治疗肿瘤的初期，肿瘤生长会得到明显的抑制甚至表现出实体瘤明显减小的治疗效果，在初期治疗中病人的病情也表现得较为稳定。但是，随着治疗的继续，最终会有很多病人对顺铂疗法产生耐药性（尤其在结直肠癌、肺癌和前列腺癌患者身上表现更为明显）。并且，有很大一部分最初呈顺铂敏感性的肿瘤最终都会发展出药物抗性（这种现象多发生在卵巢癌患者身上）。此外，临床使用顺铂作为治疗药物时会采用静脉注射给药，避光2小时内滴完，由于顺铂具有不可忽略的肾毒性，给药剂量较大时(80-120 mg/m2)须同时进行水化和利尿，病人需要长期住院治疗。耐药性和肾毒性很大程度的限制了顺铂在肿瘤治疗中的应用，因此在顺铂之后的研究中的主要策略集中在两个方面:逆转耐药性和降低肾毒性。
　　口服给药途径相对于其他给药途径具有良好的患者依从性及安全性，是目前应用最为广泛的给药途径，临床统计数据显示约有80％的药物在应用中选择口服给药途径。本课题组和其他实验室已有研究表明，酵母真菌等微生物可经胃肠道感染大量分布于体内的巨噬细胞，因此我们设想可以通过肿瘤部位的单核/巨噬细胞募集效应来实现相应的抗肿瘤药物的靶向递送。
　　目的：本研究提出构建顺铂/酵母微囊(PreCDDP/YC)的口服靶向药物递送系统。首先合成带氨基的顺铂前药和酵母微囊(Yeast capsule，YC)，再通过两者之间静电作用形成递送系统;然后评价其安全性以及体内外的抗肿瘤效果;旨在实现顺铂衍生药物的口服抗肿瘤效果，以此降低静脉滴注的副作用，提高患者依从性使之无需长期住院就能轻松实现口服药物化疗的治疗过程。
　　方法:
　　1.酵母微囊的制备
　　称取一定重量的食用酵母，分别经过NaOH溶液和HCl溶液处理，然后用异丙醇和丙酮除去可溶组分，室温真空干燥后即得YC。
　　2.酵母微囊最佳制备条件的研究
　　为了使制备得到的酵母微囊具有最大的负载能力，我们对制备过程中的酸碱处理时间对YC包埋效率的影响进行了研究，在除核步骤中，首先固定碱处理时间不变，改变酸处理时间即可得到最佳酸处理时间;然后再固定酸处理时间不变，改变碱处理时间即可得到最佳碱处理时间。
　　3.顺铂前药的制备
　　称取一定量的CDDP原料药分散在水中成混悬液，加入硝酸银晶体，一定条件下过夜反应后得到的药物溶液真空冷冻干燥即得顺铂前药物(PreCDDP)-cis-[Pt(NH3)2(H2O)2](NO3)2的冻干样品。
　　4.顺铂/酵母微囊口服靶向递送系统的制备和表征
　　称取一定质量的YC，分散在水中形成混悬液，然后放置在37℃恒温孵箱中孵育;称取一定质量的PreCDDP冻干样品，在水中混悬并超声至完全溶解。将孵育过的YC混悬液同PreCDDP溶液混合，37℃油浴孵育，得到的溶液离心后去掉上清液，沉淀在室温下真空干燥即得PreCDDP/YC，然后透射电子显微镜和扫描电子显微镜下观察其形态学。之后我们同样对PreCDDP/YC最佳制备条件进行了研究。
　　5.药物递送系统的体外释放实验
　　将制备好的PreCDDP/YC混悬pH1.2的HCl溶液和pH7.4的磷酸盐缓冲液中，模拟药物口服后在胃肠道中的释放过程，得到的不同时间点的释放样品，样品中的铂原子浓度采用原子吸收光谱法(Atomic Absorption Spectroscopy，AAS)测定，通过计算药物的累积释放百分率，绘制相应的药物释放曲线。
　　6.药物递送系统对巨噬细胞生物学活性的影响
　　将浓度梯度的PRECDDP溶液与小鼠源性巨噬细胞细胞株Raw264.7共同孵育，研究PreCDDP/YC对巨噬细胞生物学活性的影响。
　　7.药物递送系统的体外抗肿瘤活性
　　复苏并培养人源性乳腺癌细胞MCF-7及其耐药株MCF-7/ADR，人源性肝癌细胞HepG2，人源性宫颈癌细胞Hela，人源性肺癌细胞A549等肿瘤细胞株，然后将其和不同剂量的PreCDDP/YC共孵育24 h和48 h，加入CCK8试剂，用酶标仪测定细胞吸光度然后计算存活率。
　　8.药物递送系统的体内抗肿瘤活性
　　A549细胞经裸鼠左侧腋下皮下接种，待肿瘤体积大小2 cm3时，口服给予不同剂量的PreCDDP/YC混悬液，评价其体内抗肿瘤活性，并于CDDP静脉注射组荷瘤裸鼠比较;裸鼠经过治疗处死后取其血液，心、肝、脾、肺、肾及肿瘤，计算脏器指数，测定血常规和肝肾功各项指标水平的变化。
　　9.药物递送系统的安全性评价
　　30只雄性Balb/c小鼠随机分为5组，分别给予生理盐水灌胃，PreCDDP/YC高剂量灌胃，PreCDDP/YC低剂量灌胃，CDDP原料药灌胃组以及CDDP静脉注射，五次给药后通过小鼠体重变化对比毒性。
　　结果:
　　1.食用酵母菌经过酸碱处理后成功获得了外壁主要由β-1，3-D-葡聚糖构成的酵母微囊，粒径较为均匀的分布在2.5-3μm，Zeta电位约为-10 mV。酵母微囊的形态学表征结果也表明大部分的酵母真菌细胞内容物已被除去。
　　2.通过对酵母微囊制备最佳条件的研究，我们得出经过碱处理1.5h、酸处理0.5 h之后，酵母微囊负载正电荷纳米粒性能最高。
　　3.PreCDDP与YC在共孵育的过程中通过静电作用成功构成了PreCDDP/YC系统，我们对其最佳制备条件的研究表明共孵育时间为1h、PreCDDP选取pH7的超纯水作为溶剂时YC对PreCDDP的包封率较好且不影响到药物的性质。PreCDDP/YC的形态学表征实验结果表明包药后的YC内容物明显增多，细胞形态更加丰满且表面可见明显且均匀的凹凸。
　　4.体外药物释放实验表明PreCDDP/YC可在胃肠道环境下缓慢均匀的释放，并且具有较好的稳定性。
　　5.PreCDDP/YC递送系统对巨噬细胞生物学活性无显著性影响。
　　6.体外抗肿瘤实验的结果表明PreCDDP/YC对几种不同种类的肿瘤细胞具有剂量依赖性和时间依赖性的细胞毒性，可有效抑制肿瘤细胞增殖。
　　7.为研究PreCDDP/YC的体内抗肿瘤效应，我们给无胸腺裸鼠注射A549细胞，成功建立了A549肺癌移植瘤裸鼠模型，然后对荷瘤小鼠进行随机分组，采用不同治疗方案进行治疗，经过一段时间后发现PreCDDP/YC口服和CDDP静脉注射均能对肿瘤的生长起到抑制作用，其中PreCDDP/YC的治疗效果呈剂量依赖性，但PreCDDP/YC口服治疗肿瘤过程中不会造成顺铂所造成的小鼠体重明显下降，并且也不会影响血液中各因子的含量以及小鼠的肝功能、肾功能。此外活体成像的实验结果也表明酵母微囊靶向集中在肿瘤部位，在治疗中有助于提高肿瘤局部药物浓度起到更好的抗肿瘤作用。
　　8.相比临床上采用的顺铂的给药方式，PreCDDP/YC对小鼠的体重无影响，对其脏器指数，肝肾功和血常规指标也没有造成显著性的影响，HE染色切片也证明了PreCDDP/YC口服给药对小鼠脏器未造成损伤，具有较好的安全性。
　　结论:
　　1.成功制备对正电荷纳米粒有较好负载性的酵母微囊，基于静电作用，可将制备的带正电荷的顺铂前药高效负载于其中，通过肿瘤部位的单核/巨噬募集效应，酵母微囊负载系统可靶向聚集于肿瘤部位并被巨噬细胞吞噬达到治疗作用。
　　2.PreCDDP/YC口服药物递送系统具有较好的安全性，在肿瘤治疗中，相对于传统的CDDP静脉注射治疗方案，PreCDDP/YC能够靶向治疗肿瘤效果的同时又减轻了CDDP的毒副作用。
　　总之，本课题基于一些真菌等微生物可经过胃肠道感染体内大量分布的巨噬细胞的途径的认识，构建了顺铂/酵母微囊口服药物递送系统。传统的铂类药物通常以静脉注射方式进行治疗，我们首先对顺铂分子结构进行了一定程度的改造，使之形成带有正电荷的顺铂前药，通过静电作用与酵母微囊形成口服药物递送系统，大大改善了顺铂静脉注射造成的一些毒副作用，制备方法简单高效，因此具有良好的应用前景。

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