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脑出血后TLR4/NMDAR在NLRP3炎性体介导的炎症性损害中的作用及机制研究

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摘要

第一章 前言

第二章 脑出血后Hemin对小胶质细胞上TLR4和NLRP3通路活化的影响

2．1 材料和方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 TLR4参与hemin诱导NLRP3所介导炎症损害的机制研究

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

第四章 神经受体NMDAR1在hemin诱导NLRP3炎性体活化中的作用及机制研究

4．1 材料和方法

4．2 结果

4．3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述

研究生期间发表的论文

致谢

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摘要

脑出血（Intracerebral hemorrhage，ICH）是一种由脑组织自身出血引起的脑中风，其致死率与致残率显著高于缺血性脑中风和蛛网膜下腔出血。尽管如今医疗卫生技术突飞猛进，但对于脑出血仍无十分有效的治疗措施。近年来研究发现，最初的出血以及血肿的占位效应引起原发性脑损伤，而炎症反应则是导致继发性脑损伤的重要原因。虽然近些年人们开始重视对脑出血的研究，但脑出血引起继发性炎症损伤的具体机制尚不是很明确。
　　脑出血后的炎症反应主要是由于活化的炎症细胞的积聚，例如血液细胞（巨噬细胞、白细胞）和脑内固有细胞（星形胶质细胞、小胶质细胞和肥大细胞）。这些活性细胞能释放一些炎症介质，包括细胞因子、趋化因子、前列腺素和其他免疫活性分子。在所有炎症细胞中第一个对脑损伤做出反应的便是小胶质细胞。活化的小胶质细胞形状类似于血液巨噬细胞，因此它也被称作脑内的巨噬细胞。大量研究结果证明，脑出血早期小胶质细胞便被激活并释放一系列有毒成分，包括细胞因子、趋化因子、环氧合酶2(COX-2)和活性氧(ROS)等。因此，小胶质细胞在脑出血后继发性损伤中起到关键性作用。
　　在过去几十年，先天免疫系统启动的机制被广泛研究。病原相关分子模式(PAMP)和危险相关分子模式(DAMP)被认为是主要引起先天免疫和炎症反应的两种刺激方式。PAMP主要与外源性病原微生物感染有关，其中胞膜上的TLRs和胞浆内的NLR这两种模式受体家族，为典型的PAMP-PRR炎症信号启动经典通路。而DAMP则主要感受内源性危险信号，包括破碎组织细胞，及其相关代谢产物等，并由此诱发相关的炎症反应，导致继发的炎症性损害。近来研究发现NLRP3作为最具代表性的NLRs，它在识别损伤细胞或破碎组织等释放的内源性危险分子过程中发挥不可或缺的作用。
　　脑出血继发性损伤主要原因是脑组织炎症反应引起的细胞死亡，可导致脑水肿、邻近血管收缩、细胞毒性和酸中毒等。然而，缺血性脑中风也会产生以上情形，不过没有脑出血如此严重。两者严重程度的差异是由于神经纤维网中血液的出现，其中游离血红素(hemin)可能为其主要原因。Hemin是血红蛋白的分解产物，它是引起脑出血后继发性脑损伤的主要因素之一。因其具有强氧化性，hemin成为机体危险刺激信号，从而可激活天然免疫系统。
　　自1975年发现，中枢神经系统可以直接作用于免疫，使动物的免疫反应形成条件反射，人们逐渐开始关注神经与免疫的关系。长期以来，人们一直认为，免疫系统对神经系统的调节是通过免疫因子作用于神经系统上的免疫受体发挥影响;反之，神经系统可通过释放神经递质或激素，作用于免疫细胞上的神经受体发挥神经系统对免疫系统的调节作用。在天然免疫系统中，NLRP3是最具代表性的免疫受体，也是诱导无菌性炎症反应至关重要的受体;在神经系统中，N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)是一种门控离子通道型神经受体，NMDA自主神经可以支配各个免疫器官，有研究表明，NMDAR在小胶质细胞诱导的炎症反应中同样发挥着重要作用，那么小胶质细胞作为神经系统内的免疫细胞，其同时还分别表达着典型的神经受体NMDAR，以及典型的天然免疫受体NLRP3，这两种受体之间在启动神经系统的继发性炎症损害中存在怎样的联系，非常值得进行深入细致的研究，遗憾的是至今尚未见任何相关研究报道。
　　目的:体内外实验共同研究hemin对小胶质细胞上TLR4和NLRP3炎性体成分表达的影响;进一步研究TLR4和NLRP3这两个炎症受体之间的关系;探讨神经受体NMDAR1在免疫受体NLRP3活化中的作用。
　　方法:
　　1.建立hemin注入纹状体模拟脑出血模型，蛋白印迹技术(WB)检测TLR4、NLRP3、ASC和IL-1β的表达，免疫荧光双标检测ASC和IL-1β在小胶质细胞上的表达情况。
　　2.Hemin刺激小胶质细胞，WB检测TLR4、NLRP3、ASC、caspase-1及IL-1β的表达，ELISA检测TNF-α和caspase-1的分泌情况。
　　3.通过动物模型及体外细胞培养，明确TLR4在hemin诱导NLRP3活化中的作用，WB检测TLR4缺失对NLRP3及IL-1β表达的影响，免疫共沉淀(IP)检测TLR4与NLRP3的相互作用。
　　4.观察应用NMDAR1抑制剂后，WB检测NLRP3和IL-1β表达的变化，IP检测NMDAR1与NLRP3的相互作用。
　　结果:
　　1.Hemin注入纹状体可诱导小胶质细胞活化，增加TLR4、NLRP3、ASC和IL-1β的表达。
　　2.Hemin刺激小胶质细胞可上调TLR4、NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的表达及增加TNF-α和caspase-1的分泌，且具有一定的时间和浓度依赖性。
　　3.TLR4的缺失可减弱NLRP3炎性体的活化，且两者可以产生直接相互作用。
　　4.抑制NMDAR1可降低NLRP3介导的炎症反应，同时hemin刺激能增强NMDAR1与NLRP3的结合。
　　结论:
　　脑出血后，hemin激活脑内的小胶质细胞，诱导NLRP3信号通路介导炎症性损害;同时，TLR4和NMDAR1通过与NLRP3产生蛋白-蛋白偶联作用，协同参与了NLRP3炎性体的活化。

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