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受体活性修饰蛋白1过表达对降钙素基因相关肽促MG-63增殖和分化作用的影响研究

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摘要

外周感觉神经所分泌的神经肽类物质对骨代谢和骨折修复重建具有重要生物学调控作用,部分神经肽类物质的促成骨增殖和分化作用在体内外实验中分别得以证实。降钙素基因相关肽(calcitoningene-relatedpeptide,CGRP)在体内有广泛的分布和表达,CGRP与降钙素(calcitonin)来源于同一基因,在骨代谢、胃肠道、心血管和疼痛机制的调节中具有极其重要的病理及生理学意义。自从在骨痂中发现CGRP阳性神经纤维表达开始,研究人员通过转基因小鼠和基因敲除小鼠等体内实验证明了CGRP的促成骨效应,也在体外实验中发现了CGRP可以促进成骨细胞(Osteoblast,OB)的增殖,并证实了成骨细胞表面CGRP受体的存在,并发现了其下游的环磷酸腺苷(CyclicAdenosinemonophosphate,cAMP),细胞内游离钙离子(IntracellularCa2+,[Ca2+]i)和丝裂原激活激酶(mitogen-activatedproteinkinaseMAPK)等信号通路。
　　本课题组已在前期实验中证实CGRP能明显刺激体外培养的人MG-63成骨细胞样细胞和鼠成骨细胞的增殖和分化,并且探究了MG-63细胞蛋白质组在CGRP参与的骨创伤修复过程中的变化。YANLi等实验已发现CGRP在口腔颌面部骨创伤修复中的重要作用,并且在体外证实CGRP可影响成骨细胞的代谢。骨创伤修复过程中,新生的感觉神经末梢在骨痂中分泌的CGRP等神经肽类物质促进了骨创伤的修复重建。
　　CGRP受体位于细胞膜上,由降钙素受体样受体(calcitoninreceptor-likereceptor,CRLR)、受体活性修饰蛋白(receptoractivitymodifyingproteins,RAMPs)和受体组分蛋白(receptorcomponentprotein,RCP)组成,属于G蛋白偶联受体,包括降钙素受体(calcitoninreceptor,CTR)和CRLR。RAMP与CGRP受体的可塑性有关,可调节CRLR与CGRP的结合,不同的RAMP与CRLR结合表现为对不同配体具有特异的受体表型,从而介导CGRP的生物学效应。目前发现RAMPs家族包含3个成员:RAMP1、RAMP2和RAMP3,RAMPs作为受体调节的限速蛋白,决定了配体的受体表型及作用强弱,但RAMP1表达与CGRP促进成骨细胞增殖和分化的关系研究较少。
　　综上所述,本项实验通过构建RAMP1真核表达载体,转染MG-63细胞,观察RAMP1过表达对CRLR表达量和膜分布的影响,探究RAMP1过表达对CGRP促进MG-63细胞增殖及分化作用的影响,为阐明神经多肽系统在口腔颌面部骨创伤修复中的机制打下基础。
　　方法:
　　1.细胞培养:人MG-63细胞按常规方法进行培养。以5×106/瓶密度接种于100ml培养瓶中培养传代,加入含青霉素105U/L、链霉素100mg/L的10％FBS高糖DMEM培养基,置于5%CO2孵箱中37°C孵育72或96h传代,6-8代细胞用于实验,待细胞密度达到80%饱和时(细胞达对数生长期)用于实验分组。
　　2.实验分组与操作程序:待细胞培养至对数生长期,生长密度达到80%以上时,按106个/孔的密度将细胞接种于6孔板后采用完全随机(完全随机设计也叫组间设计,被试被分成若干组,每组分别接受一种实验处理,有几种实验处理被试也相应的被分为几组,各实验组的被试之间相互独立,因而又叫“独立组”设计)将其分为3组(每组的样本量为5),①RAMP1过表达组:将所构建的RAMP1真核表达载体转染细胞并筛选出稳定表达的单克隆,待后续实验使用;②空载体组:将pcDNA3.1(+)空载体转染细胞并筛选出稳定表达的单克隆,待后续实验使用;③空白对照组:不转染目的基因,相同实验条件下培养。
　　3.RAMP1对MG-63细胞膜CRLR的调控作用:
　　3.1RAMP1真核表达载体的构建:在美国国立生物技术信息中心(NationalCenterofBiotechnologyInformation,NCBI)上查找实验所需人RAMP1的基因序列,根据所查序列和实验需要设计RAMP1基因开放阅读框(openreadingframe,ORF)PCR引物,用总RNA提取试剂盒提取MG-63细胞总RNA,进行逆转录酶的作用合成目的cDNA,将cDNA和pcDNA3.1(+)载体分别用BamHI-HindIII双酶切并连接转化大肠杆菌DH-5α扩增,为了验证RAMP1目的基因序列是否有突变,将含有重组子的菌液送华大基因测序,选取无突变的单克隆菌液保种,经测序正确后提取质粒,并检测所提取质粒浓度。
　　3.2转染细胞并筛选稳定表达细胞系:将所培养的细胞以5000个/孔的密度接种于96孔板,用不同浓度的G418培养基培养细胞,以10~14d杀死全部细胞的浓度为基本浓度,并以此确定筛选浓度和维持浓度。转染前一天按106个/孔的密度将所培养细胞接种于6孔板,按脂质体转染的标准程序转染细胞,转染48h后用含G418的培养基按600mg/L的浓度筛选转染成功的细胞,2周后以250mg/L的浓度维持筛选压力,挑选并在96孔板中培养成阳性单克隆,扩大培养将稳定转染的细胞用于后续实验。用共聚焦显微镜观察RAMP1及CRLR在MG-63细胞膜上的分布及表达情况;利用蛋白质印迹法分别检测3组细胞RAMP1和CRLR的蛋白表达水平;用实时PCR检测3组细胞RAMP1和CRLR的mRNA表达情况。
　　4.CGRP对MG-63细胞增殖和分化的作用:
　　4.1增殖:CCK-8法检测在0、24、48、72、96h时RAMP1过表达组/空载体组/空白对照组细胞的增殖情况;使用流式细胞仪分别在0、8、16、24h时分别收集RAMP1过表达组/空载体组/空白对照组细胞并分析其细胞周期。
　　4.2分化:ALP染色定性检测RAMP1过表达后CGRP对MG-63细胞ALP表达的作用;茜素红染色定性检测RAMP1过表达后CGRP对MG-63钙化结节作用;Realtime-PCR定量检测RAMP1过表达后CGRP对MG-63CollagenⅠmRNA表达的影响;ELISA定量检测CGRP对MG-63碱性磷酸酶和OC的表达的影响。
　　结果:
　　1.RAMP1真核表达载体构建:RAMP1基因的基因开放阅读框(openreadingframe,0RF)克隆进pcDNA3.1(+)载体,经BamHI-HindIII双酶切后琼脂糖电泳可见相对分子质量为467bp的条带,经测序鉴定碱基对无突变,表明成功构建了pcDNA3.1(+)-RAMP1真核表达载体。
　　2.G418筛选及RAMP1过表达检测:G418培养液递增筛选2周后未转染成功的细胞全部死亡,维持筛选25d后形成阳性克隆。
　　Western-blot和ImageJ灰度扫描分析结果显示,RAMP1过表达组、空载体组、空白对照组RAMP1蛋白灰度值分别为43.57±1.50、30.26±1.51、26.77±2.73,表明稳定转染的MG-63细胞的RAMP1蛋白表达显著高于其他两组(P=0.013,P<0.05)。Realtime-PCR结果显示,RAMP1过表达组、空载体组、空白对照组的RAMP1mRNA的相对表达量分别为9.351±2.062、1.457±0.298、1.218±0.224,表明稳定转染的MG-63细胞的RAMP1mRNA的表达也显著增加,与空白对照组相比差异有统计学意义(F=336.892,P=0.000,P<0.01),与空载体组相比差异也有统计学意义(F=304.772,P=0.000,P<0.01),可认为重组载体在细胞内已有较高转录水平。
　　3.RAMP1过表达对MG-63细胞膜上CRLR的影响:Western-blot和ImageJ灰度扫描分析结果显示,RAMP1过表达组、空载体组、空白对照组CRLR蛋白灰度值分别为45.08±2.42、30.16±2.05、26.45±1.16,RAMP1过表达组的CRLR蛋白表达显著高于其他两组(P=0.011,P<0.05)。Realtime-PCR结果显示,RAMP1过表达组、空载体组、空白对照组的CRLRmRNA的相对表达量分别为5.281±1.337、1.342±0.264和1.277±0.282,表明稳定转染的MG-63细胞的CRLRmRNA的表达也显著增加,与空白对照组相比差异有统计学意义(F=178.109,P=0.000,P<0.01),与空载体组相比差异也有统计学意义(F=166.537,P=0.000,P<0.01)。免疫荧光染色结果显示,RAMP1过表达组的CRLR的红色荧光亮度明显高于其他两组,表明CRLR蛋白在细胞膜上的表达高于其他两个组。
　　4.CGRP对MG-63细胞增殖和分化的作用:
　　4.1增殖:RAMP1过表达组的A值分别为0.390±0.016、0.628±0.175、0.896±0.592、1.055±0.004、1.179±0.618,均显著高于相同时间点其他两组A值(P<0.05),在72h时,较空白对照组(0.786±0.048)差距最明显。流式细胞仪检测结果显示,RAMP1过表达组S期百分率分别为(1.25±0.13)%、(68.79±0.56)%、(64.49±1.59)%、(57.82±0.75)%,均显著高于其他两组(P<0.01),在8h时,较空白对照组[(41.24±1.77)%]差距最明显。
　　4.2分化:相同浓度CGRP(10–8mol/L)作用下RAMP1过表达组细胞ALP染色光密度值高于对照组(P<0.05或P<0.01);相同浓度CGRP(10–8mol/L)作用下RAMP1过表达组细胞茜素红染色计数高于对照组(P<0.01);相同浓度CGRP(10–8mol/L)作用下RAMP1过表达组细胞CollagenⅠmRNA的表达高于对照组(P<0.05或P<0.01);相同浓度CGRP(10–8mol/L)作用下RAMP1过表达组细胞ALP的表达高于对照组(P<0.05或P<0.01)。
　　结论:
　　1.RAMP1过表达能够促进CRLR蛋白在MG-63细胞膜上的表达并可能增强其从胞内向胞膜上的转运,使CRLR在MG-63细胞膜上的分布增加,增加细胞膜上CGRP受体的直接结合位点。
　　2.RAMP1过表达能增强CGRP对MG-63细胞促增殖作用,CCK-8法检测结果显示,在0、24、48、72、96h时RAMP1组的A值均显著高于其他两组(P<0.05),在72h时最显著。RAMP1过表达组与其他两组相比细胞S期百分率明显增加,在8h时RAMP1过表达组与其他两组S期百分率的差距最大,与相同时间点空白对照组相比差异有统计学意义(F=603.18,P<0.01)。
　　3.RAMP1过表达能增强CGRP对MG-63细胞促分化作用,增加了MG-63细胞的CollagenⅠmRNA和ALP的表达,并且在相同浓度CGRP(10–8mol/L)作用下,经茜素红和ALP染色可见RAMP1过表达组的钙化结节更明显。

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