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TLR4/NF-κB在低氧暴露下大鼠肠道屏障功能损伤及细菌移位中的作用研究

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第一章 前言

第二章 实验性高原胃肠道损伤大鼠模型的制备

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 TLR4/NF-κB在低氧暴露下大鼠肠道屏障功能损伤及细菌移位中的作用研究

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

3.5 小结

全文结论

参考文献

文献综述紧密连接蛋白claudins磷酸化在胃肠屏障中的作用

参考文献

攻读硕士期间发表的论文

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摘要

研究背景及意义：
　　急性重症高原病(ASMS)是机体快速抵达高原后,由于低压性缺氧导致组织脏器在短时间内发生严重代谢功能及能量供应障碍,并伴有明显临床表现的一组症候群,主要包括高原肺水肿(HAPE)和高原脑水肿(HACE)。此类疾病发展迅猛、极易导致扩大的炎症反应、死亡率高,严重危及急进高原人群的健康。虽然目前针对肺和脑本身的研究较多,但关于其发病机制至今仍然存在较大争议,研究陷入了瓶颈。而对于肺外及脑外机制,却关注较少,这为我们从另一方面研究ASMS的发病机理提供了一个新的切入点。
　　胃肠道作为人体重要的器官,同时也是人体最大的储菌库和内毒素库。正常情况下,肠道粘膜的各种生理性屏障可以保证致病因素不能越过屏障侵入肠道以外的地方,TLR4/NF-κB由于其在胃肠的高表达及其特异性配体LPS在肠道细菌的广泛存在,引起我们的关注。肠道在遭受打击或应激状态下,屏障完整性被破坏,肠道就成了各种毒素和病原微生物入侵机体的门户,随着多种炎症介质“瀑布样”级联活化效应,可诱发全身炎症反应综合征(SIRS),进而损伤远隔器官,形成“肠源性感染”。故目前多数学者认为肠道在应激时,是多器官功能障碍(MODS)的始动器官。毫无疑问,高原低压性缺氧对机体是一种强烈的应激。
　　国内外已有的研究证实,缺氧可能引起细菌的移位,而这种屏障的损伤、细菌的移位是通过何种机制,以及TLR4/NF-κB在其中是否发挥重要作用,尚未见报道。基于以上背景,我们采用亚洲最大的低压模拟舱群模拟高原环境,建立实验性高原胃肠道损伤大鼠模型,以此研究低氧暴露下肠道屏障功能损伤及细菌移位的作用机制,为深入理解重症高原病的发病机理提供新的靶点,有重要的临床意义。
　　研究方法：
　　1.实验性高原胃肠道损伤动物模型的建立:成年健康雄性SD大鼠60只,采用随机数字法分为平原对照组(C)、单纯缺氧组(H),并根据高原特殊气候环境及卫生条件下机体胃肠道疾病易感性增加的特点,加设了单纯缺氧+LPS处理组(HL),每组各20只。C组置于平原环境,H组和HL组饲养于模拟海拔7000m处,温度25℃,光暗周期24h,HL组按计划给药。三组均于72h后处死取材。通过检测肠道细菌移位、肠粘膜超微结构改变、血清内毒素水平等情况,综合判定动物模型。
　　2.TLR4/NF-κB在低氧暴露导致的大鼠肠道损伤中的机制探讨:成年健康雄性SD大鼠100只,采用随机数字法分为平原对照组(C)、单纯缺氧组(H)、缺氧+100mg/kg·bwPDTC组(HP)、缺氧+0.5mg/kg·bwLPS组(HL)、缺氧+PDTC+LPS组(HPL),各组按既定方案给药,并按上诉方法复制实验性高原胃肠道损伤动物模型。减压结束后(72h),平原组在平原环境取材,其余四组在模拟海拔4500m处取材。检测各组动物肠外组织细菌移位情况、细菌生化鉴别、肠道粘膜超微结构改变和硝酸镧示踪分布、血清内毒素水平,同时测定动物肠道TLR4mRNA表达水平、NF-κB、Occudin蛋白含量及血清中炎症介质TNF-α、IL-6的浓度差异。
　　实验结果：
　　1.C组大鼠活跃,精神兴奋,腹腔无肉眼可见炎症反应。H组及HL组大鼠活动减少,精神明显萎靡,肠管可见明显肿胀,肠粘膜充血。HL组可见少量腹水及肠系膜淋巴结肿大。HP组及HPL组活动减少,精神较萎靡,肠腔可见轻微肿胀,未见明显粘膜充血。
　　2.与C组比较,H组和HL组肠外组织器官中检测出肠源性细菌,肠道细菌移位率显著增高,HL组增高更加明显(P<0.05)。三组动物血清LPS检测结果与细菌移位情况一致。电镜显示,H组、HL组肠粘膜萎缩、脱落,细胞器可见不同程度损伤,细胞间紧密连接间隙增宽,硝酸镧示踪可见La3+透过肠上皮和血管内皮广泛分布于上皮紧密连接、基底膜及血管外间质。
　　3.采用PDTC干预后,HP组相对于H组、HPL组相对于HL组,细菌移位率显著降低(P<0.05),血清LPS检测结果与细菌移位情况一致。透射电镜观察显示,HP组、HPL组分别较H组、HL组损伤明显减轻,细胞器形态基本正常,仅局部可见硝酸镧分布于细胞基底膜。
　　4.与对照组比较,H组和HL组血清TNF-α、IL-6含量明显升高(P<0.05),HP组、HPL组炎症因子含量分别较H组、HL组降低(P<0.05)。荧光定量RT-PCR和Westernblot分别对TLR4mRNA、NF-κBp65表达量的检测与血清因子结果一致(P<0.05)。而采用Westernblot对紧密连接蛋白Occludin的检测结果与NF-κBp65结果呈相反趋势,H组、HL组降低,干预后HP组、HPL组显著增高(P<0.05)。
　　实验结论：
　　1.采用低压舱模拟7000米低压性缺氧环境可有效建立实验性高原胃肠道损伤及细菌移位的动物模型,为进一步研究重症高原病的发病机制提供基础。
　　2.急性低氧暴露对大鼠空肠上皮超微结构损伤严重,以肠道微绒毛、上皮细胞和血管内皮细胞间紧密连接处明显。细胞内各细胞器亦有不同程度的损伤。
　　3.TLR4/NF-κB信号通路的激活参与了这一病理过程的发生发展,其机制涉及上皮超微结构破坏、构成紧密连接复合体主要成分的occludin蛋白下调、NF-κB下游炎性介质TNF-α、IL-6的大量释放。而TLR4直接介导的细菌跨细胞途径可能也参与其中。
　　4.NF-κB特异性抑制剂PDTC可有效阻断TLR4/NF-κB信号通路的激活,使肠道屏障功能损伤和细菌移位情况减轻,提示TLR4/NF-κB通路可能是高原胃肠损伤防治的有效干预靶点。

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