• 主题
高级搜索  >
历史搜索 清空历史
首页> 中文学位 >树突状细胞与神经干/祖细胞共培养促进神经干/祖细胞分化的体外研究
【6h】

树突状细胞与神经干/祖细胞共培养促进神经干/祖细胞分化的体外研究

代理获取
页面导航
  • 目录
  • 摘要
  • 著录项
  • 相似文献
  • 相关主题

目录

封面

目录

缩略语表

英文摘要

中文摘要

第一章 前言

第二章 树突状细胞和神经干/祖体细胞共培养促进神经干/祖体细胞分化的实验研究

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 方法

2.1.3统计方法

2.2 结 果

2.2.1 原代培养的鉴定

2.2.2 原代细胞培养鉴定小结

2.2.3 共培养体系下NSPCs分化结果

2.2.4 共培养体系下NSPCs凋亡检测

2.3 讨 论

第三章 树突细胞和神经干/前体细胞共培养促进神经干细胞分化的机制研究

3.1 前 言

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2 方法

3.3 结 果

3.3.1 Western blot分析

3.3.2 ELISA检测

3.4 讨 论

全文总结

问题与展望

参考文献

文献综述内源性NSPCs与脊髓损伤治疗的研究进展

参考文献

硕士期间发表论文

致谢

展开▼

摘要

中枢神经系统的损伤,包括脊髓损伤(spinecordinjury,SCI),颅脑外伤和中风。这种损伤的特点为细胞死亡和/或轴突损伤,同时伴随神经通路的继发性损伤导致的功能障碍。通常这种功能障碍是永久性的,因为人体在神经系统损伤时不能自我修复。神经干/祖细胞(Neuralstem/progenitorcells,NSPCs)是一种多潜能干细胞,且对神经系统疾病和损伤具有反应能力,具有自我更新和多向分化潜能。在体外培养状态下能增殖和自我分化为三种神经细胞:神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞。由于NSPCs的存活、增殖及分化难于调控,一直是研究及应用NSPCs的瓶颈。因为没有NSPCs存活,细胞既不能分化,更谈不上与宿主整合。因此,只有当移植的NSPCs存活并分化为神经细胞,才能对NSPCs修复的治疗效果进行有效的评估[1]。
　　当前研究人员通过物理支持、基因调控、细胞共移植等方法改变神经系统局部微环境,促进神经干细胞的存活、分化[2,3]。研究证明NSPCs联合神经营养因子移植治疗神经系统疾病实验取得一定疗效[4]。神经营养因子能够改变损伤局部微环境,促进NSPCs的存活和分化[5]。经过脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)[6,7],神经营养素3(Neurotrophin-3,NT-3)[8-10],神经生长因子(NerveGrowthFactor,NGF)[11,12]基因修饰过的实验鼠能促进NSPCs存活和分化为神经元。未成熟树突状细胞(dendritiscells,DCs)能自身分泌NGF、BDNF、NT-3等多种神经营养因子,同时作为抗原提呈细胞,在吞噬抗原活化成熟的过程中,能进一步释放神经营养因子[13]。本课题组前期试验证实DCs与NSPCs共培养,发现共培养上清液中神经营养因子NT-3含量比其他组显著增高,且神经球数量增多。两种细胞联合移植促进脊髓损伤修复,同样观察到损伤区域NT-3分泌量显著增加[14](P<0.05)。
　　为了进一步观察共培养条件下DCs对NSPCs生物效应,我们假设体外DCs通过NT-3促进NSPCs存活、分化。先建立NSPCs与DCs共培养体系,检测培养基上清中不同时间点神经营养因子的表达,观察NSPCs表面神经营养因子特异性受体的表达变化,这些表达变化对NSPCs存活、分化的影响。观察NTs/TrkC受体下游信号通路蛋白的表达变化。
　　研究目的:
　　观察神经营养因子及其相应的受体变化对NSPCs生物效应的作用,为调控内源性和外源性NSPCs的存活、增殖、分化及NSPCs移植治疗神经系统疾病提供理论依据。
　　1.构建DCs和NSPCs共培养体系,检测培养基上清神经营养因子的分泌情况。2.观察共培养体系下,神经营养因子表达变化对NSPCs存活、分化的影响及可
　　能的作用机制。
　　材料与方法:
　　1.新生SD大鼠全脑组织神经干细胞原代培养
　　NSPCs来源于普通新生SD大鼠(1~3d)全脑组织,参照Mistry等[15]人培养方法进行原代培养,传代培养2次后收集上清,制备细胞悬液备用,为细胞共培养做准备。
　　2.骨髓源性DCs的原代培养
　　参照Hauben等[16]人的培养方法制备SD大鼠(3~4w)胫骨骨髓来源的DCs,传代3次后收集备用。为细胞共培养做准备。
　　3.NSPCs与DCs共培养
　　构建Transwell小室NSPCs与DCs共培养体系。实验共分5个组,每组重复实验6次。①空白对照组(NSPCs组):培养第2代NSPCs离心收集消化后,取2ml1×105/mlNSPCs滴加在6孔培养板内,第3天半量换液。②实验组(NSPCs/DCs组):收集培养第3代的DCs,细胞浓度为1×106/ml,取1ml滴加在12孔培养板Transwell共培养体系中(上室),下室滴加1ml1×102/ml第2代NSPCs(上下室接种密度比为10:1)进行分隔培养。③阳性对照组(NSPCs+NT-3组):细胞滴加方法同NSPCs组,培养孔中加入1μgNT-3。④阴性对照组(NSPCs/DCs+抗-NT-3组):方法同NSPCs/DCs组,在培养孔中加入200μg抗-NT-3。⑤DCs组:培养第3代DCs离心收集消化后,取2ml1×106/mlDCs滴加在6孔培养板上,第3天半量换液。共培养3d后换液,第7天后倒置显微镜下观察NSPCs形态,收集上清备用。观察NSPCs分化实验。
　　4.ELISA检测各实验组NT-3浓度
　　细胞共培养24、48、72h后,参照ELISA试剂盒(武汉博士德公司)说明书操作方法,检测各实验组上清中NT-3浓度。
　　5.荧光免疫细胞化学技术
　　培养板底部铺上无菌盖玻片,NSPCs和DCs分化共培养7天后,收集各组盖玻片,4％多聚甲醛固定,PBS清洗,0.3%Triton100处理细胞,1%BSA牛血清白蛋白封闭,加入一抗:兔抗β-微管蛋白3(β-tubulin-Ⅲ)多克隆抗体(1:200,)/小鼠抗GAPDH多克隆抗体(1:200),4℃过夜,37℃复温2h,PBS洗3次,加二抗:羊抗兔Fitic(1:300)/小鼠抗鸡CY3(1:300),37℃复温2h,PBS洗,Hochest避光染核3~5分钟,PBS洗3次后,中性树胶封片。在荧光显微镜下(Leica,德国)每个实验组随机读取4~6个视野,计算GFAP、β-tubulin-Ⅲ阳性细胞,采用ImageProPlus6.0图像处理软件分析荧光表达面积(荧光值范围70~250)。
　　6.Westernblot分析
　　收集各组NSPCs细胞,进行细胞裂解提取总蛋白,考马斯亮蓝比色法初步测定蛋白含量,上样量为80μg,进行10%SDS-PAGE凝胶电泳,PVDF转膜,5%脱脂奶粉室温封闭2h;加入一抗,二抗,发光、曝光、显影、定影。Labwork4.6软件分析图像结果。
　　7.流式细胞仪检测
　　收集离心NSPCs,不含EDTA的胰酶将神经球消化成单细胞,胎牛血清终止消化后,PBS洗涤3次,重新收集细胞,使细胞浓度为1~5×105/ml。加入500mlBindingBuffer和5μlAnnexinV-FITC混合后加入5μlProdidiumIodide混匀。避光反应10分钟。半小时内进行流式细胞仪的观察和检测。每组实验重复6次,对流式细胞仪的结果进行统计分析。
　　8.统计学分析
　　数据以x±s表示,采用SPSS13.0统计软件,ELISA结果采用多因素重复测量方差分析,荧光免疫细胞化学结果和流式细胞仪结果采用单因素方差分析。
　　结果：
　　1、ELISA检测
　　共培养24、48、72h上清液中NT-3浓度检测结果显示:NSPCs/DCs组NT-3浓度24h开始上升,72h开始逐步下降。DCs组上清NT-3含量持续增高。DCs组、NSPCs/DCs组3个时间点NT-3的含量较NSPCs组、NSPCs/DCs+抗-NT-3组相应时间点显著增高(P<0.05),NSPCs+NT-3组NT-3的含量维持在35.25±0.82pg/ml。
　　2.免疫细胞化学检测
　　激光共聚焦显微镜下每孔随机选5个视野中的阳性细胞总数进行计算,观察到NSPCs/DCs组、NSPCs+NT-3组β-tubulin-Ⅲ阳性细胞数量多且轴突相互交错;NSPCs组、NSPCs/DCs+抗NT-3组β-tubulin-Ⅲ阳性细胞少且轴突短小(图2-1)。NSPCs/DCs组、NSPCs+NT-3组神经元荧光值比其他两组显著增高(P<0.05)。NSPCs组、NSPCs/DCs+抗NT-3组GFAP阳性细胞核小,胞突分支多,相互交错(图2-2)。NSPCs/DCs组、NSPCs+NT-3组GFAP阳性细胞数量少。
　　3.Westernblot分析
　　共培养72h后,NSPCs/DCs组、NSPCs+NT-3组NSPCs中磷酸化的细胞外调节蛋白激酶(P-ERK1/2)的表达量明显高于NSPCs组、NSPCs/DCs+抗NT-3组(P<0.05),各组GAPDH的灰度值之间的比值之间无差异:无统计学意义(P>0.05)。
　　4.流式细胞仪检测
　　流式细胞仪检测结果发现:NSPCs/DCs组PI值:3.75%,FITC值:5.96%;NSPCs+NT-3组PI值:3.13%,FITC值:7.78%;NSPCs组PI值:11.28%,FITC值:8.38%;NSPCs/DCs+抗NT-3组PI值:14.66%,FITC值:8.63%。NSPCs/DCs组和NSPCs+NT-3组PI值组间无差异(P>0.05),与NSPCs组和NSPCs/DCs+抗NT-3组之间有显著差异(P<0.05)。
　　结论:
　　1.DCs和NSPCs共培养促进NSPCs向神经元分化,减少星形胶质细胞的生成。这一生物效应的机制是由于在共培养条件下有助于NT-3的分泌,NT-3优化NSPCs培养的环境,激活TrkC/MEK-P-ERK1/2信号通路,减少NSPCs的凋亡,促进NSPCs向神经元分化,减少星形胶质细胞的生成。
　　2.作为抗原提呈的DCs将会是一类调控体内NSPCs治疗SCI的非常有运用前景的细胞。

著录项

相似文献

  • 中文文献
  • 外文文献
  • 专利
代理获取

客服邮箱：kefu@zhangqiaokeyan.com

京公网安备：11010802029741号 ICP备案号：京ICP备15016152号-6 六维联合信息科技 (北京) 有限公司©版权所有

  • 客服微信

  • 服务号