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川芎嗪对模拟高原低氧暴露下大鼠肺水肿的保护作用及机制研究

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第一部分川芎嗪对低氧刺激大鼠肺微血管内皮细胞通透性增高的影响

第二部分川芎嗪对低氧诱导大鼠PMVEC通透性增高的作用机制研究

第三部分川芎嗪对模拟高原低氧诱导大鼠肺微血管通透性增高影响的研究

第四部分川芎嗪对模拟高原低氧诱导大鼠肺微血管通透性增高影响的机制研究

全文结论

致谢

文献综述中药川芎中有效成分川芎嗪的药理作用研究进展

攻读博士期间发表的论文

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摘要

背景和目的：
　　 高原肺水肿(high altitude pulmonary edema，HAPE)是一种重型急性高原病，起病急、进展快、危害大，若不及时救治，可能危及生命。目前针对HAPE 预防与救治的方法仍然有着成本高、救治相对滞后和疗效不佳的弱点。随着国家高海拔地区经济开发力度的加强，以及国防建设的需要，迫切需要开发新型的针对HAPE的简便、有效防治手段。
　　 尽管HAPE的发病机制至今尚未完全阐明，但内皮功能失调和细胞损伤导致的肺毛细血管屏障通透性增加在HAPE中的重要地位已非常明确。如何对抗高原低氧氧化应激状态所引起的血管内皮损伤，是干预HAPE 形成的一个重要靶点。川芎嗪(Tetramethylpyrazine, TMP)是从植物川芎(Ligusticum chuanxiong Hort.)中提取的生物碱，对缺血再灌注损伤大鼠心、肾、脑等多个器官都具有保护作用，亦用于脑中风、冠心病等动脉粥样硬化性疾病的治疗。体外实验显示TMP 预处理人脐静脉内皮细胞后，H2O2诱导的凋亡显著减少。研究还发现，TMP的保护作用与其所具有的强效抗氧化应激能力密切相关。TMP能通过提高机体内源性SOD 活性，抑制白细胞呼吸爆发全过程和抑制高钙催化黄嘌呤的转化过程，减少了氧自由基的生产，减轻脂质过氧化物对组织的损伤，维持细胞膜的完整性及渗透性。所以我们推测如果以TMP为抗氧化剂来对抗HAPE 氧化应激反应、保护内皮细胞功能，降低肺微血管的渗漏，可能会成为HAPE 防治的一条有效途径。高原低压低氧时器官的病理和氧化性损伤变化，与缺血再灌注损害的相关改变有着非常高的相似性，这为研究TMP对高原性肺损伤的保护作用提供了理论上的可行性。
　　 因此，本研究拟利用细胞实验和整体动物实验相结合的方法，从细胞水平和整体水平探讨TMP对机体的保护作用。首先观察在低氧状态下TMP对大鼠肺微血管内皮细胞(Pulmonary microvascular endothelial，PMVEC)通透性的影响及作用机制。然后通过模拟高原低氧环境复制肺水肿大鼠模型，采用尾静脉给药预保护的方式，观察TMP对大鼠肺血管、内皮通透性，肺动脉高压的改善以及代谢水平和氧化应激的影响和作用，为今后此类疾病的防治提供理论依据。
　　 方法：
　　 1.采用外周肺组织贴块法培养大鼠PMVEC，取组织块进行切片观察，以大鼠肺动脉平滑肌细胞和人脐静脉内皮细胞为对照，对培养细胞进行CD34、植物凝集素BSI、Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色鉴定，通过光镜和透射电镜观察细胞形态和超微结构。
　　 2.将大鼠PMVEC 随机分为正常对照组和低氧处理2h、4h、6h、12h、24h和48h组,采用单层细胞通透性装置检测细胞渗透系数。然后将大鼠PMVEC 随机分为正常对照组、低氧模型组、低氧+TMP50μg/ml组、低氧+TMP100μg/ml组和低氧+TMP200μg/ml组，检测各组细胞渗透系数。
　　 3.将大鼠PMVEC 随机分为正常对照组、正常+TMP200μg/ml组、低氧模型组和低氧+TMP200μg/ml组，通过ROS 试剂盒检测细胞内ROS，reAltime-PCR及Westernblotting 方法检测细胞中HIF-1α和VEGF-A mRNA和蛋白表达水平。
　　 4.通过模拟高原低氧低压环境复合运动方式制备模拟高原低氧肺水肿大鼠模型，将TMP通过尾静脉注射入大鼠体内，大鼠随机分为正常对照组、正常+TMP120mg/kg组、低氧模型组、低氧+DEXA 5mg/kg组、低氧+TMP30mg/kg组、低氧+TMP60mg/kg组和低氧+TMP120mg/kg组，分别测定各组大鼠动脉血氧分压(PaO2)、肺动脉压(PAP)、肺组织含水量和肺微血管通透性(PMVP)，并取肺组织进行病理切片HE 染色观察。
　　 5. 利用模拟高原低氧大鼠肺水肿模型，将大鼠随机分为正常对照组、低氧模型组和低氧+TMP120mg/kg组，分别测定各组大鼠肺组织SOD 活性和MDA 含量、血清和BALF中TNF-α和IL-6 含量、血浆儿茶酚胺含量。通过reAltime-PCR 法、WesternBlotting 法及免疫组织化学染色法分别检测各组肺组织HIF-1α和VEGF-A mRNA和蛋白表达水平。
　　 结果：
　　 1.组织块法培养大鼠PMVEC的综合鉴定结果显示：组织块源于外周肺组织，Ⅷ
　　 因子相关抗原和CD34免疫荧光化学染色阳性，植物凝集素BSi结合试验阳性，透射电镜细胞表面有较多突起，细胞核较大，线粒体丰富。
　　 2.与正常对照组比较，低氧模型组大鼠PMVEC 单层细胞通透性明显增高，并呈时间依赖性；TMP50μg/ml组、TMP100μg/ml组、TMP200μg/ml组细胞通透性明显低于低氧模型处理组，并呈剂量依赖性。
　　 3.与正常对照组比较，低氧模型组细胞内ROS、HIF-1α和VEGF-A mRNA和蛋白表达水平明显增高，而TMP200μg/ml 处理细胞后，与低氧模型组细胞相比，TMP组细胞内ROS、HIF-1α和VEGF-A mRNA和蛋白表达水平明显降低。
　　 4.大鼠模拟高原环境低氧处理后，其PO2较正常对照组明显减低，PAP、肺含水量、PMVP 均较正常对照组明显增高；而地塞米松处理组PO2明显增高，PAP、肺含水量、PMVP 显著降低；川芎嗪处理组PO2明显增高，PAP、肺含水量、PMVP 显著降低，并呈剂量依赖性。同时，肺组织切片HE 染色显示地塞米松处理组和川芎嗪处理组肺水肿程度较低氧模型组减轻。
　　 5.与正常对照组比较，低氧模型组大鼠肺组织SOD 活性明显下降，MDA 含量、血清和BALF中TNF-α和IL-6 含量、血浆儿茶酚胺含量显著增高，肺组织HIF-1α和VEGF-A mRNA和蛋白表达水平也明显增高；TMP120mg/kg 处理组大鼠肺组织SOD活性较低氧模型组显著升高，MDA 含量、血清和BALF中TNF-α和IL-6 含量、血浆儿茶酚胺含量较低氧模型组显著降低，肺组织HIF-1α和VEGF-A mRNA和蛋白表达水平较低氧模型组明显减低。同时，免疫组织化学染色结果也显示HIF-1α和VEGF-A蛋白表达水平较低氧模型组减低。
　　 结论：
　　 1.成功分离培养大鼠肺微血管内皮细胞，细胞类型、纯度和活力均能满足后续体外实验研究的要求。低氧刺激24h 会导致大鼠PMVEC 单层细胞通透性增高，呈时间依赖性；而TMP 预处理细胞能够显著抑制低氧状态下细胞通透性增高，呈剂量依赖性。
　　 2.低氧可以通过激活ROS-HIF-VEGF通路增加大鼠PMVEC细胞通透性；而川芎嗪能有效抑制细胞氧化应激，阻止下游HIF-1α的激活和VEGF-A表达增加，从而发挥减低细胞通透性的作用。
　　 3.成功建立模拟高原低氧暴露下大鼠肺水肿模型。TMP 预处理能有效减轻模拟高原低氧环境下大鼠肺水肿程度，并呈剂量依赖性。
　　 4.TMP 用于高原肺水肿可以通过以下途径发挥其降低肺水肿程度的作用：①减轻高原低压低氧引起的氧化应激所致的肺损伤。②抑制炎性因子活化、儿茶酚胺释放引起的损伤和渗出，保护组织细胞结构的完整性。③抑制血管内皮生长因子VEGF及其上游调控信号低氧诱导因子HIF-1α的表达，保护肺微血管。

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