头孢他啶阳离子脂质体复合n-HA/β-TCP陶瓷支架的制备、体外溶出机理及其体外抗金黄色葡萄球菌生物膜的研究

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骨髓炎作为一类骨进行性感染，可以导致骨的炎症性破损、骨坏死等一系列严重后果，并可能发展成为慢性和顽固性状态。慢性骨髓炎最常见的感染细菌是金葡菌，该细菌可以通过形成生物膜等形式迅速产生耐药性，是一种通过外科干预和抗生素治疗难以治愈的细菌生物膜感染。近年来，抗生素复合支架治疗慢性骨髓炎在临床不断偿试，但治疗效果常不理想。而且，感染部位的高浓度抗生素可抑制内皮细胞及成骨细胞生长，从而影响骨骼的生长、代谢。因此，有必要研制一种新型的靶向性抗生素支架来治疗金葡菌生物膜感染。
　　以往研究表明，阳离子脂质体抗生素能减少细菌的聚集，同时对细菌生物膜有很强的亲和力，从而增加抗生素在生物膜表面的药物浓度。本实验发现，头孢他啶阳离子脂质体比同等含量的头孢他啶对金黄色葡萄球菌生物膜的生长具有更强的抑制作用。由于人体网状内皮系统中的肝脏枯否细胞及脾脏巨噬细胞对脂质体抗生素具有很强的清除作用，限制了其静脉注射途径的应用。因此，将抗生素阳离子脂质体复合到人工骨支架上，进行局部使用，成为慢性骨髓炎研究的热点之一。
　　目前常用的支架有很多种，各有其优点和局限性，例如玻璃珠或陶瓷，它们的制备过程常常需要很高的温度或者热压烧结，这样使得药物或脂质体与其复合时，只能选择在空白支架制成后采用浸泡-真空抽虑或离心的方式进行，其最大的缺点是可能会造成脂质体结构的破坏并且不能保证脂质体在支架的孔隙间的均匀分布，不利于临床剂量的控制和使用；而如丙烯酸骨水泥等则需要用到有机溶剂，这些制备步骤容易造成脂质体结构的破坏，并且其在体内不能降解，需二次手术取出，增加了患者痛苦和感染等风险。我们在预实验中，曾偿试将脂质体与磷酸钙骨水泥进行复合，但支架成型困难，难于应用。到目前为止，尚缺乏一种既能完成载药，同时又能实现骨替代目标的理想的支架。近年来，纳米羟基磷灰石/β-磷酸三钙(n-HA/β-TCP)陶瓷作为一种载体的应用受到一些研究者的青睐，其具有良好的生物相容性、可降解性和骨生物特性，因此，本研究选择其作为脂质体抗生素的支架。
　　本研究首先制备了头孢他啶阳离子脂质体，研究其特性，进而制备头孢他啶阳离子脂质体复合纳米羟基磷灰石/β-磷酸三钙支架，探讨了头孢他啶阳离子脂质体溶液以及头孢他啶阳离子脂质体陶瓷支架在体外释放的机制，初步探讨了头孢他啶阳离子脂质体复合纳米羟基磷灰石/β-磷酸三钙支架对金黄色葡萄球菌生物膜体外抑制作用。
　　课题包括三部分：1、头孢他啶阳离子脂质体的制备及其性质研究。2、头孢他啶阳离子脂质体复合纳米羟基磷灰石/β-磷酸三钙陶瓷支架的制备及体外释药性能的研究。3、头孢他啶阳离子脂质体复合纳米羟基磷灰石/β-磷酸三钙陶瓷支架对金黄色葡萄球菌生物膜体外抑制作用研究。
　　第一部分：头孢他啶阳离子脂质体的制备及其性质研究
　　实验方法：
　　 1.逆相蒸发法制备CLC。
　　 2.HPLC检测头孢他啶色谱条件和样品处理方法。
　　 3.头孢他啶阳离子脂质体与游离药物的分离方法。
　　 4.正交法确定CLC制备最佳处方。
　　 5.在电镜下观察CLC的形态，并采用激光散射法测定其粒径和ζ-电位。
　　主要实验结果：
　　制备的CLC为多囊脂质体；通过正交实验，确定逆相蒸发法制备CLC的最佳配方为：磷脂(Soya phosphatidylcholine SPC)：硬脂酰胺(Stearamide SA)：胆固醇(CholesterolChol)为7:1:1(mol/mol/mol)，脂质：药物5:1(w/w)，有机相：水相3:1(v/v)；制备的CLC的平均粒径、ζ-电位、PH值和包封率分别为161.5±5.37nm、60.60±5.24mV、6.90±0.07和16.57±0.13%，脂质体在4℃和-80℃条件下保存3m，稳定性良好，药物泄漏率<5.0%。
　　第二部分：头孢他啶阳离子脂质体复合纳米羟基磷灰石/β-磷酸三钙陶瓷支架的制备及体外释药性能的研究
　　实验方法：
　　 1.应用高温烧结法制备纳米羟基磷灰石/β-磷酸三钙(n-HA/β-TCP)陶瓷支架。
　　 2.应用浸泡-真空抽滤法，将头孢他啶游离药和阳离子脂质体与n-HA/β-TCP陶瓷支架的复合。
　　 3.头孢他啶游离药和阳离子脂质体复合n-HA/β-TCP陶瓷支架体外释药性研究。
　　主要实验结果：
　　电镜显示并证实，制备后的复合支架完整保存了脂质体的结构，从支架中释放的主要是脂质体不是游离药物；实验结果和数学分析显示，不论头孢他啶游离药支架，还是头孢他啶阳离子脂质体复合支架，其体外释放机制都能良好地拟合溶解/扩散的Fickian过程。
　　第三部分：头孢他啶阳离子脂质体复合纳米羟基磷灰石/β-磷酸三钙陶瓷支架对金黄色葡萄球菌生物膜体外抑制作用研究
　　实验方法：
　　 1.按照NCCLS M7-A8要求检测CLC对金黄色葡萄球菌的敏感性。
　　 2.采用生物膜再生实验方法研究支架释放的CLC对金黄色葡萄球菌生物膜和耐青霉素金黄色葡萄球菌生物膜的敏感性和抑制率。
　　主要实验结果：
　　头孢他啶和CLC对金黄色葡萄球菌的MIC值分别为6.0μg/ml和4.25μg/ml；而对耐青霉素金黄色葡萄球菌的MIC值分别为8.0μg/ml和3.16μg/ml。CLC比游离头孢他啶对金黄色葡萄球菌生物膜和耐青霉素金黄色葡萄球菌生物膜的形成均具有更强的抑制作用。头孢他啶阳离子脂质体复合纳米羟基磷灰石/β-磷酸三钙陶瓷支架能够持续释放脂质体并对金黄色葡萄球菌生物膜的形成具有抑制作用。
　　主要结论：
　　 1、采用逆相蒸发法制备头孢他啶阳离子脂质体方法简便，重现性好，包封率较高。
　　 2、多孔的n-HA/β-TCP陶瓷支架能够成功地与头孢他啶阳离子脂质体复合；无论是游离头孢他啶还是CLCs，从支架释放都是基于溶解/扩散的Fickian过程。
　　 3、头孢他啶阳离子脂质体溶液和头孢他啶阳离子脂质体n-HA/β-TCP陶瓷支架，能在体外实验中显著抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成。
　　 4、头孢他啶阳离子脂质体复合纳米羟基磷灰石/β-磷酸三钙陶瓷支架可以作为新的局部载药系统，在临床治疗生物膜感染引起的骨髓炎方面起到重要作用。
　　
　　
　　
　　

著录项

作者
周田华;
展开▼
作者单位

第三军医大学;

展开▼
授予单位第三军医大学;
学科外科学(骨科)
授予学位博士
导师姓名徐永清;
年度 2012
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类生物材料学;骨及骨膜的感染;
关键词
葡萄球菌生物膜; 控制性药物释放; 头孢他啶阳离子脂质体; HA/β-TCP陶瓷支架; 体外溶出机理; 骨髓炎;

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