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辅阻遏子c-ski转基因治疗促进伤口愈合和减轻瘢痕形成的作用研究

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第三军医大学研究生学位论文独创性声明及版权使用授权书

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摘要

前言

第一部分 c-ski对成纤维细胞增殖及胶原分泌的影响

第二部分 利用PcDN3.0裸质粒建立创伤愈合转基因治疗动物模型的研究

第三部分c-ski转基因治疗促进大鼠皮肤伤口愈合作用的研究

第四部分c-ski转基因治疗减轻瘢痕形成的作用观察

全文总结

致谢

文献综述一Smad3与创伤愈合*

文献综述二伤口愈合和基因治*

附件一c-ski原癌基因及其生物学活性*

攻读硕士研究生期间发表的论文

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摘要

创伤是一个重要的疾病，在我国每年因创伤致伤数百万，更让人担忧的是，专家们预测，进入21世纪以后，创伤人数可能成倍地增长。为此，如何加快创伤后组织修复是临床上的一个重要问题，也是提高损伤康复后生活质量的需要。虽然，目前人们研究并发现了许多具有促增殖、抗凋亡的促修复因子，其中最有代表性的是生长因子(bFGF、KGF等)，但是，由于这些因子中有的受到创面受体表达缺乏、变异、蛋白酶浓度升高及生长因子比例失衡等因素的影响，难以达到理想的促愈效果，有的甚至有增加瘢痕形成的副作用，使这些因子的应用受到很大的限制。因此，探讨正常创伤愈合的机制，寻求新的非受体作用途径的促增殖剂，对促进创伤愈合尤其是放创复合伤、大面积创伤、烧伤等难愈伤口有着十分重要的意义。 c-ski是鸟类病毒癌基因v-ski的细胞内同源物，在不同类型的组织和细胞中分布广泛。过量表达的ski可促进鸡胚成纤维细胞增殖，诱导其肌肉分化。c-ski可以抑制Smad3、Smad2活性，还可调节多种核因子的转录活性，如促进NFI(促核因子I)的转录而抑制癌基因Rb的转录，参与神经系统发育、造血细胞的增殖和分化、肿瘤发生、组织再生等多种生理病理过程。在创伤愈合方面c-ski有无作用呢？1999美国NIH小组首次报道，Smad3基因敲除小鼠的伤口愈合速率增加了2倍，这一结果证实了抑制Smad3具有促愈作用；同时，近些年研究表明TGF-beta信号系统是导致瘢痕形成的重要原因，而Smad3和Smad2做为TGF-beta途径重要的信号因子，在瘢痕形成中具有重要作用，因此，抑制Smad3和Smad2成为了减轻瘢痕形成的新途径。这些都提示c-ski基因作为Smad3、Smad2的辅阻遏子，其可能在伤口愈合、瘢痕形成和放创复合伤愈合方面具有作用，但到目前为止尚未见有直接证据报道。 为此，本课题首先采用体外细胞基因转染技术来明确c-ski对成纤维细胞增殖及胶原分泌的作用，其次利用pcDNA3.0裸质粒局部皮下注射来建立创伤愈合转基因治疗动物模型并评价其应用价值。在此基础上，进一步对c-ski在创伤愈合中的作用进行以下两个方面探讨：(1)c-ski转基因治疗促进大鼠皮肤伤口愈合的作用；(2)c-ski转基因治疗减轻大鼠愈后瘢痕和兔耳增生性瘢痕形成的效果，得到的主要结果与结论如下： 1.体外细胞实验显示转c-ski基因显著促进成纤维细胞增殖，且具有剂量依赖性；同时c-ski可降低Ⅰ型胶原蛋白表达。提示c-ski作为一个促增殖因子在有促愈作用的同时，又因可降低胶原合成而具有潜在地抑制瘢痕形成的作用。 2.细胞实验发现：Smad3抑制增殖，而Smad2具有促增殖作用，c-ski可以逆转Smad3对成纤维细胞增殖的抑制作用和Smad2对成纤维细胞的促增殖作用，明确了在成纤维细胞内c-ski可以抑制Smad3和Smad2的作用，这不仅提示抑制Smad3的作用可能是c-ski促增殖的机理之一，而且说明抑制Smad2也可以降低细胞增殖作用，这也表明c-ski对成纤维细胞可能有双重调节作用。 3.创伤愈合转基因治疗动物模型实验发现：pcDNA3.0-lacZ质粒可在大鼠伤口中表达，并且主要表达于皮下成纤维细胞，表达时间以一周内为主，对照侧无表达；同时利用检测pcDNA3.0-f-c-ski质粒的Flag标签蛋白的表达，发现外源性c-ski可在大鼠伤口中表达，进而WesternBlot检测转基因治疗后c-ski表达量明显高于对照并同时检测到其中有flag抗体阳性，表明pcDNA3.0-f-c-ski转染可通过外源性c-ski表达而提高c-ski表达量，这为在体基因治疗实验打下了坚实的基础。 4.大鼠创伤模型c-ski裸质粒局部皮下注射显示：c-ski可以加快大鼠皮肤伤口愈合速度，愈合时间上比单纯创伤对照缩短达25％左右，且具有显著性差异；同时注射生理盐水与单纯创伤对照无差别，而注射空pcDNA3.0却延长伤口愈合时间，证明c-ski确实具有促进伤口愈合作用。 5.c-ski促愈的量效及时效分析：在3-100ug/伤口的剂量范围内创面愈合缩短时间与剂量成正比，伤后即刻治疗的愈合时间比伤后3天短；注射频率上，每周注射比单次注射治疗的疗效好；同时应用阳离子脂质体与质粒联合转染未发现有提高疗效的作用。从以上实验结果我们得到了一个较佳的基因治疗方案：伤后即刻开始，每周100ug/伤口剂量的裸质粒局部皮下注射。 6.创伤后c-ski治疗侧在0-6天愈合速度快于对照侧并有显著性差别，在6-9天与对照差别不明显，9天之后随着剩余面积减小而创面愈合速度比对照减小，因此0-6天即创伤早期是c-ski促愈的关键时期，同时c-ski治疗侧表现为炎性浸润下降、肉芽组织增多、上皮爬行快等，这些也可能是c-ski促愈的机制。 7.应用贝复济(rb-bFGF)做为疗效的阳性对照，我们发现c-ski转基因治疗侧愈合时间为15.5天，而贝复济治疗侧为17.1天，c-ski治疗侧比贝复济治疗侧愈合时间缩短达10％左右，且愈后瘢痕面积c-ski治疗侧比对照侧减小约50％，两者相差具有统计学意义。 8.c-ski对大鼠伤口愈后的作用：在1.5月到2月之间瘢痕面积最大，c-ski基因治疗可以抑制愈后瘢痕形成，在愈合后的各观察时相点瘢痕面积均低于对照约50％；组织切片观察胶原含量两者无明显差别，但从分布上，c-ski治疗侧似网状，瘢痕胶原成熟度高更接近正常皮下胶原，同时c-ski治疗侧无瘢痕向正常组织延伸现象，这可能是c-ski抑制瘢痕形成的因素之一。 9.c-ski对兔耳瘢痕模型的作用：c-ski可显著促进其创伤的愈合，并使瘢痕的外突高度及体积大为减少；组织切片观察显示c-ski治疗侧相对瘢痕厚度低，胶原含量少。表明c-ski对增生性瘢痕同样具有抑制作用，同时提示抑制胶原合成可能是c-ski抑制增生性瘢痕形成的重要原因。

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