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诺帝抑制恶性胶质瘤细胞对化学趋化因子和生长因子刺激的反应

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第三军医大学研究生学位论文独创性声明及第三军医大学研究生学位论文版权使用授权书

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摘要

前言

第一部分恶性胶质瘤细胞表达FPR和诺帝对其抑制作用

第二部分诺帝对FPR介导的恶性胶质瘤细胞增殖与趋化功能的抑制作用

第三部分诺帝对FPR介导的恶性胶质瘤细胞信号转导的干扰作用

全文总结

致谢

图版

文献综述去甲二氢愈创木酸及其衍生物的抗肿瘤活性及其机制

攻读博士学位期间撰写和发表论文和综述目录

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摘要

快速增殖、高度侵袭和活跃的血管生成是脑恶性胶质瘤的重要生物学特性，其结果是严重破坏中枢神经系统的结构与功能并常因肿瘤占位而致死。尽管近二十年来的恶性胶质瘤手术、化疗、放疗甚至基因治疗等多种治疗措施有明显进步，但是并未能很好地延长病人的生存期。因此，如同其它肿瘤一样，探寻恶性胶质瘤新的治疗靶点和治疗方法十分必要和重要。 本课题研究小组近来发现，G-蛋白偶联受体家族中甲酰化肽受体(formylpeptidereceptor，FPR)在恶性胶质瘤组织中呈现阳性表达，且与肿瘤级别和微血管密度有密切关系，即它具有促进肿瘤生长和血管生成的新功能。细菌源性多肽如N-甲酰化甲硫酰-亮氨酰-苯丙氨酰胺(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine，fMLF)和一些宿主源性的多肽如来源于肿瘤细胞或其它宿主细胞线粒体的一些多肽，均能与FPR结合，进而介导细胞的迁移和增殖。这一结果提示FPR类似于传统的生长因子受体，可能是肿瘤治疗的新靶点。 去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiareticacid，NDGA)是一种天然的脂氧化酶抑制剂。我们以前的研究结果表明，NDGA能抑制胶质瘤的生长并能促进其分化。我们基于天然NDGA的结构，合成了其手性化合物诺帝(Nordy)。研究发现，诺帝具有强烈的抗癌效应。 鉴于恶性胶质瘤中FPR功能意义尚需进一步明确，诺帝抗肿瘤机制是否涉及FPR介导的血管生成作用亦未认识，本课题对此进行了研究。首先，我们观测了三种常用胶质瘤细胞系中FPR的表达及其与细胞分化之间的关系，并观察了诺帝对这种表达的影响；然后，重点研究了人源性恶性胶质瘤细胞U87上FPR的功能活性即该受体活化后细胞增殖、迁移、[Ca2+]i变化和上调血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的产生，以及诺帝对FPR这种功能活性和表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)介导的细胞反应的抑制作用；最后，我们研究了上述过程中细胞信号分子功能状态(磷酸化水平)的变化。主要研究结果和结论如下： 1.采用定量免疫细胞化学技术，以胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)和vimentin为胶质瘤分化标记物，定量观测了人胶质瘤细胞系U87和BT325及大鼠胶质瘤细胞系C6的FPR表达，结果显示，三种细胞系均表达有FPR蛋白，分化程度最低的U87细胞FPR表达最高，提示FPR与胶质瘤分化有关。100μM诺帝处理后三种细胞的上述FPR表达降低(P＜0.05)，但RT-PCR检测结果未发现FPRmRNA表达下降(U87细胞)。 2.以U87细胞为实验材料，以fMLF(100nM)和合成的W-肽(100nM)作为FPR的激动剂，以EGF(10ng/ml)作为EGFR的刺激物，采用48孔趋化小室进行细胞趋化迁移实验、记数法检测细胞增殖、Fura-2AM作指示剂测定细胞的钙动员、RT-PCR测定VEGFmRNA表达和ELISA法检测VEGF分泌水平，评估了U87细胞FPR的功能和诺帝(25，50和100μM)对这些功能反应的影响。结果显示： (1)fMLF或EGF均能显著地促进细胞增殖，25μM诺帝未能显著地影响U87细胞的增殖，但50和100μM诺帝显著地抑制由fMLF或EGF诱导的U87细胞的增殖。 (2)fMLF，W-肽或EGF可以非常显著地引起U87细胞的趋化迁移，50和l00μM的诺帝可以抑制此趋化作用。 (3)fMLF和W-肽均以浓度依赖性形式激发细胞内[Ca2+]i的产生，诺帝处理后经上述刺激，钙内流的变化呈现为双相，即当低浓度(低于25μM)诺帝处理，细胞内[Ca2+]i增强，而高浓度(50μM以上)诺帝处理，[Ca2+]i被抑制。 (4)fMLF刺激FPR后能上调VEGFmRNA表达和VEGF蛋白分泌水平，并呈浓度依赖性；诺帝显著降低了fMLF引起的VEGFmRNA表达和蛋白分泌水平的增高。 3.以U87细胞为试验材料，以fMLF和EGF分别激活FPR和EGFR两受体，以诺帝为处理药物，采用Westernblot方法对细胞信号分子MAPKs(ERK、JNK和p38)、Akt、IкB和EGFR(Try992)及EGFR(Try845)的磷酸化水平进行了检测。结果显示，fMLF可以快速而短暂地诱导MAPKs(ERK、JNK和p38)、Akt及IrB的磷酸化。高剂量(50、100μM)诺帝可以显著削弱此效应，并呈剂量依赖性。EGF也以快速而短暂地诱导EGFR(Try992)和EGFR(Try845)的磷酸化，此磷酸化水平被高剂量(100μM)的诺帝所抑制。 上述结果提示，恶性胶质瘤细胞不同程度地表达FPR，并与细胞分化程度相关；表达于U87细胞的FPR激活后具有多重效应(功能)，包括促进瘤细胞增殖、迁移、Ca2+流动和VEGF的产生，而诺帝明显抑制FPR的表达和功能效应；诺帝对MAPKs、Akt、IкB和EGFR蛋白磷酸化水平和钙动员的抑制作用可能是其抑制恶性胶质瘤细胞增殖、迁移和血管生成重要分子机制。上述结果对认识胶质瘤生长和侵袭机制、了解诺帝抗肿瘤药理的分子机制都具有理论意义，对诺帝的开发应用也具有重要的指导价值。

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