Foxp3基因转染的CD4+CD25-T细胞对小鼠心脏移植物存活的影响

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CD4+CD25+调节性T细胞因具有强大的免疫抑制能力在器官移植领域引起了广泛的关注，可能成为诱导器官移植后免疫耐受的有效手段之一，但由于可应用的细胞数量过少限制了其临床应用。模拟体内条件对其进行的体外扩增取得了一定的成果，但这种方法耗时长，费用昂贵，实验条件要求高而无法推广。Foxp3的发现为我们提供了另外一种选择，利用基因转染技术将Foxp3基因导入CD4+CD25-T淋巴细胞，能够使其获得与自然发生的CD4+CD25+调节性T细胞相似的细胞表型，以及与之相当的调节能力，使得获得足够的调节性T细胞成为一种可能。目的：通过逆转录病毒载体pLXSN介导小鼠Foxp3基因进入小鼠CD4+CD25-T细胞，使其转化为具有免疫抑制能力的调节性T细胞。研究此细胞体外抑制自身淋巴细胞增殖的能力，体内对小鼠异位心脏移植物存活的影响。方法： 1.利用原始质粒pMD18-T-Foxp3构建Foxp3逆转录病毒体系pLXSN-Foxp3-IRES2-EGFP，以PA317为包装细胞生产病毒上清，感染来自C57BL/6小鼠脾脏的CD4+CD25-T淋巴细胞，将Foxp3基因及报告基因EGFP同时引入靶细胞，通过观察EGFP的表达及流式细胞仪检测评价转染效率。 2.将小鼠CD4+CD25+调节性T细胞、转染Foxp3基因的CD4+CD25-T淋巴细胞分别与同系小鼠脾脏分离得到的单个核细胞在CD3、CD28单克隆抗体、mIL-2存在的情况下进行混合培养，72小时后加入3H-TdR，继续培养18小时，测定cpm值，通过与空白对照组相比判断培养体系的增殖程度。 3.建立小鼠器官移植模型：将Chen-z-h的小鼠颈部异位心脏移植模型术式进一步改进，以BALB/c小鼠为供体，C57BL/6小鼠为受体建立稳定可靠的小鼠异位心脏移植模型，为研究实体器官移植后排斥反应建立动物模型。 4.将小鼠CD4+CD25+调节性T细胞、转染Foxp3基因的CD4+CD25-T淋巴细胞分别于术前一天输入受体小鼠(C57BL/6小鼠)体内，同过观察异位心脏移植物的病理表现、存活时间评价二者对小鼠异位心脏移植物存活的影响。结果： 1.通过CD4+CD25+RegulatoryTCellIsolationKit，平均每只C57BL/6小鼠脾脏可分离出1.25×107个单个核细胞，进一步分离可获得1.12×106个CD4+CD25+T细胞和5.2×106个CD4+CD25-T细胞。分离完成后以胎盼兰染色，倒置显微镜下观察见分离所得的T淋巴细胞活性良好，存活率在95％以上。 2.原始质粒pMD18-T-Foxp3由贺伟峰博士、肖亚硕士在前期实验中构建，我们利用该质粒成功的构建了Foxp3的逆转录病毒体系pLXSN-Foxp3-IRES2-EGFP，通过包装细胞PA317细胞，可生产滴度为4.2×104cfu/ml的病毒上清，感染CD4+CD25-T淋巴细胞48小时后可以观察到靶细胞内表达明亮的绿色荧光蛋，经流式细胞仪检测，感染48小时后靶细胞的CD4分子、EGFP共表达比例为47.8％。 3.在淋巴细胞增殖反应检测中，Foxp3组结果平均为2884.89cpm，调节性T细胞组平均为2560.72cpm，经单因素方差分析二者无显著性差异(p＞0.05)。而空白对照组平均为13319.44cpm，经单因素方差分析，与Foxp3组、调节性T细胞组均有限著差异(p＜0.01)。 4.通过提高显微外科操作技术，改进血管吻合方法，完善试验条件，我们成功建立了以BALB/c小鼠为供体，C57BL/6小鼠为受体建立的小鼠颈部异位心脏移植模型，手术成功率可达95％。 5.异位心脏移植术后第7天病理学检查：空白对照组异位心脏移植物可见大量淋巴细胞浸润，组织充血水肿，甚至表现为广泛的心肌变性、坏死。Foxp3组、调节性T细胞组病理表现相似，表现为心脏组织内局灶性血管周围和心肌间质炎症细胞浸润，心肌轻度水肿或局灶性心肌损伤，炎症反应明显轻于空白对照组。 6.异位心脏移植物存活时间的观察可见Foxp3组异位心脏移植物存活时间平均为60.2天，调节性T细胞组异位心脏移植物平均存活时间62.6天，经单因素方差分析二组之间无显著差异(p＞0.05)，空白对照组异位心脏移植物平均存活时间为11.5天，与Foxp3组、调节性T细胞组之间均存在显著差异(p＜0.01)。结论： 1.本实验证实利用原始质粒pMD18-T-Foxp3能够成功构建Foxp3的逆转录病毒体系pLXSN-Foxp3-IRES2-EGFP，以PA317细胞为包装细胞，可以生产滴度为4.2×104cfu/ml的病毒上清。 2.利用CD4+CD25+RegulatoryTCellIsolationKit能够在小鼠脾脏单个核细胞中分离出高纯度的CD4+CD25+T淋巴细胞和CD4+CD25-T淋巴细胞。以PA317/pLXSN-Foxp3-IRES2-EGFP病毒上清感染C57BL/6小鼠naiveCD4+CD25-T淋巴细胞可以47.8％的效率将Foxp3基因导入小鼠靶细胞。 3.转染Foxp3基因的CD4+CD25-T淋巴细胞在体外能够显著抑制以CD3、CD28单克隆抗体刺激的同系小鼠的淋巴细胞增殖，其抑制淋巴细胞增殖的能力与自然发生的CD4+CD25+调节性T细胞能力相当。 4.小鼠遗传背景清晰，可实现严格的免疫学对照，是在移植免疫研究中经常使用的实验动物，小鼠颈部异位心脏移植操作简单，方法易于掌握，我们在实验中成功建立了小鼠颈部异位心脏移植模型，证实小鼠颈部异位心脏移植模型是一种稳定、可靠、易于推广的器官移植模型。 5.在体内实验中证实转染Foxp3基因的CD4+CD25-T淋巴细胞与自然发生的CD4+CD25+调节性T细胞一样，具有明显延长小鼠颈部异为心脏移植物存活时间，减轻移植物炎症反应的能力，可以解决自然发生的CD4+CD25+调节性T细胞数量不足的问题，成为一种在诱导器官移植物免疫耐受中有着临床应用潜力的细胞。

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作者
贾维胜;
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作者单位

第三军医大学;

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授予单位第三军医大学;
学科外科学(泌尿外)
授予学位硕士
导师姓名张艮甫;
年度 2006
页码
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类心脏;免疫分子生物学（免疫化学）;
关键词
器官移植; 免疫耐受; 调节性T细胞; Foxp3;

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