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柑橘果汁和精油中的氧杂环化合物：分析方法学、化学表征和降血压活性研究

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氧杂环化合物（oxygenated heterocyclic compounds,OHCs）是主要发现于柑橘中的一大类次生代谢产物。OHCs是母环中含有氧的杂环芳香族化合物，主要包括3个化学族系：多甲氧基黄酮（polymethoxyflavones,PMFs）、香豆素（coumarins）和呋喃香豆素（furanocoumarins,FCs），它们具有广泛的生物活性，对人类健康产生影响。果汁是柑橘加工的主要产品，OHCs在柑橘汁中以痕量存在，不同果汁中组成和含量差异很大。由于浓度低且结构相近，难以对其精确测定，文献中也少有关于果汁OHCs的有效信息。多数柑橘汁中OHCs的含量和种类以及果汁热处理过程中OHCs成分的变化情况在很大程度上仍是未知的。果皮精油是柑橘加工的重要副产品，对精油OHCs的研究也还不够全面。少有方法能够同时对3类OHCs成分进行定量分析，且这些方法通常较为耗时、需要使用昂贵的LC-MS/MS等仪器。基于上述原因，我们使用成本相对低廉的仪器设备开发了一套快速、准确和灵敏的针对柑橘汁和精油中OHCs的分析方法；还开发了与之配套的果汁样品前处理程序，达到了从果汁中完全提取和富集天然浓度极低的OHCs并去除干扰成分的效果。利用该方法分析了138份果汁和24份冷榨精油（cold-pressed oil,CPO）样品中的38种OHCs的浓度。研究了不同pH值和温度下柑橘汁中香豆素和呋喃香豆素侧链结构的变化及其反应动力学。还研究了富含OHCs的甜橙CPO缓解大鼠高血压症状的生物活性。 （1）分析方法和样品前处理方法的开发及方法学验证： 建立并优化了一种高效液相色谱方法，实现了3类OHCs共38种物质的单次进样分离。该方法采用四元流动相并与二极管阵列和荧光检测实现联用（HPLC-PDA-FL）。首先利用甲醇/乙腈/四氢呋喃（THF）分别和水组成的不同二元溶剂体系测定了38个OHCs在反相等度条件下的相对洗脱顺序；再根据各二元体系的对数容量因子图，设计并优化了四元流动相梯度，从而完全分离38个目标OHCs。优化后的方法采用C8柱，四元流动相分别为A0.025%磷酸水溶液、B甲醇、C乙腈、D水/乙腈/THF(55:20:25)，采用梯度洗脱。该方法能在50min内分离全部目标OHCs，色谱分辨率≥1.5，选择性为1.01～1.20，理论塔板数为18,000～1,500,000。 （2）柑橘精油和果汁中OHCs的组成和分布特征： 采用新开发的方法对主要采集于重庆地区的24份CPO样品和138份果汁样品进行了分析，样品涵盖了甜橙、宽皮柑橘、葡萄柚、柚、柠檬、枸橼和金柑等经济品种，对其OHCs分布模式进行了分析表征。利用主成分分析（PCA）对OHCs组成和含量数据进行处理以显示其中的特定聚类关系。探讨了OHCs在柑橘汁真实性鉴别中的应用。 CPO样品中含有34个目标OHCs。甜橙油和宽皮柑橘油中OHCs以PMFs为主，占总含量的92.2%~99.9%；甜橙油以七甲氧基黄酮含量最高，川陈皮素和桔皮素次之；宽皮柑橘油以桔皮素含量最高，5-去甲川陈皮素和川陈皮素次之。柚、葡萄柚、柠檬和枸橼以及金柑CPO所含OHCs主要由香豆素和FCs构成，占总含量的93.8%以上。柚油和葡萄柚油OHCs总含量最高，其中琯溪蜜柚CPO中含量为74.0g/L，而甜橙油中仅约为1.0g/L。 以CPO中33个OHCs为变量构建7个主成分，并对各样品进行分析。二维分值图显示，CPO样品被分为柚和葡萄柚、宽皮柑橘和甜橙以及枸橼和柠檬三大类。通过三维载荷图得知各大类CPOs的特征OHCs成分如下：柠檬和枸橼为5-香叶氧基-7-甲氧基香豆素和8-香叶氧基补骨脂素，柚和葡萄柚为橙皮油素和橙皮内酯，宽皮柑橘和甜橙则主要为5个PMFs。 （3）OHCs环氧取代基在柑橘汁加工过程中的变化特征和反应动力学： 研究了25oC时橙皮内酯和6’,7’-环氧佛手柑素（6’,7’-EB）在3种酸度（pH2.0、3.5和5.0）的模拟果汁清液和pH3.5的果汁样品清液中的反应产物和反应速率，还研究了巴氏杀菌对pH5.0和3.5果汁清液中两种物质变化的影响。总体而言，香豆素和FCs的环氧取代基在酸催化下与水反应生成对应的邻二醇，如水合橙皮内酯（MH）和6’,7’-二羟薄荷素（6’,7’-DHB）等，反应遵循亲核加成机理，在pH2.0时速率最快，而在pH5.0时几乎不发生。 橙皮内酯在25oC的pH2.0模拟清液中发生两步连续反应。第一步是侧链水合反应，即8-(3,3-二甲基-2-环氧乙基)与水加成形成8-(2,3-二羟基-3-甲基丁基)，为伪一级反应，速率常数k1=0.0697min-1，反应半衰期t1/21=9.94min。第二步反应消耗第一步反应产物MH，为表观一级反应，最终产物未知。相同温度下的pH3.5模拟清液中，橙皮内酯只发生第一步反应，为伪一级反应，k=0.00726min-1、t1/2=95.47min。 6’,7’-EB在25oC的pH2.0模拟清液中首先发生平行反应。主反应为侧链水合反应，即5-(6’,7’-环氧-香叶氧基)与水反应生成5-(6’,7’-二羟薄荷素)，为伪一级反应，速率常数k1=0.0597min-1，半衰期t1/21=11.6min。副反应使侧链从C10缩短为C5，生成异欧前胡素（IIR），该反应也遵循伪一级反应，半衰期t1/2=84.9min。上述反应的产物6’,7’-DHB和IIR继续发生连续反应，按表观一级反应规律降解，但相应的产物尚未予鉴定。相同温度下的pH3.5模拟清液中，6’,7’-EB仅发生第一步的平行反应，主反应k1=0.00532min-1、t1/21=130.3min。 25oC的pH3.5柑橘汁清液中，橙皮内酯和6’,7’-EB环氧化物的水合速率为相同条件下模拟清液中的4倍，前者kmer=0.0305±0.0025min-1、t1/2mer=22.7±2.0min，后者kEB=0.0206±0.0019min-1、t1/2EB=33.9±3.5min，引起反应速率加快的原因有待进一步研究。向pH5.0和pH3.5的柑橘汁清液中加入橙皮内酯和6’,7’-EB，采用与市售果汁巴氏热处理相似的95oC加热30s。pH5.0清液中两种环氧化物含量保持不变，而pH3.5清液中两者含量分别降低98.9%和96.3%，表明水合反应速率与pH和温度的依赖关系。 （4）富含PMFs的长叶橙冷磨精油对左旋亚硝基精氨酸（L-NNA）诱导的SD大鼠高血压的预防和缓解作用： 将7周龄的成年雄性SD大鼠分成6组，即：正常组、高血压对照组、橙皮油低剂量组（Orange Peel Oil-Low Dose,OPO-L）、橙皮油高剂量组（Orange Peel Oil-High Dose,OPO-H）、柠檬烯空白对照组和卡托普利药物治疗组，每组10只大鼠。除正常组大鼠不进行任何实验处理，其它组大鼠每日给予700mg/kg体重L-NNA灌胃，持续61天；灌胃L-NNA后，OPO-L和OPO-H组的大鼠按5mL/kg体重和10mL/kg体重分别灌胃长叶橙冷磨精油，柠檬烯组大鼠按每天10mL/kg体重灌胃D-柠檬烯，药物治疗组大鼠按每天15.6mg/kg体重灌胃卡托普利。每3天采用尾套法测量大鼠尾动脉收缩压和舒张压。第61天测量完毕后，所有大鼠采用CO2窒息处死，解剖后取血并采集心、肝、肾等组织。测定与血管舒张和收缩相关的5个活性因子的含量：用酶联免疫试剂盒测定血清中内皮素-1（ET-1）、降钙素基因相关肽（CGRP）、血管内皮生长因子（VEGF）和E-选择素，用生化试剂盒测定血清和心肝肾组织中NO和丙二醛（MDA）含量。用实时荧光定量PCR法测定心肌组织中与血压调控相关的血红素氧合酶-1（HO-1）、肾上腺髓质素（ADM）、受体活性修饰蛋白2（RAMP2）以及神经元型、内皮型和诱导型一氧化氮合酶（nNOS,eNOS和iNOS）基因的mRNA转录水平。橙皮精油中PMFs含量采用HPLC-PDA快速检测，D-柠檬烯含量采用GC-MS测定。 连续61天灌胃L-NNA后，高血压对照组大鼠的收缩压和舒张压分别达到174±6和138±4mmHg，较正常组升高近85/75mmHg。灌胃橙皮精油10mL/kgbw（含1.64mg PMFs/kgbw，OPO-H组）61天后能显著降低高血压大鼠的收缩压和舒张压（p＜0.05），两者分别下降54/43mmHg；灌胃精油5mL/kgbw（含0.82mg PMFs/kg bw，OPO-L组）也具有显著的降压效果（p＜0.05），但不及OPO-H组。 甜橙CPO显著提升高血压大鼠血清、心、肝、肾组织中NO、CGRP水平，降低了其中MDA、ET-1、VEGF、E-选择素水平，从而舒张血管，防止体内氧化损伤和血管生成。CPO上调HO-1、nNOS和eNOS在心肌中的mRNA表达，同时下调ADM、RAMP2和iNOS的mRNA表达，促进了心血管松弛和心肌细胞的保护。 所有结果均在所选剂量范围内呈正相关依赖。OPO-H组的降压效果略低于卡托普利组。通过柠檬烯对照组实验，排除了甜橙精油中含量最高的D-柠檬烯（95.8%m/m）对降压作用的贡献。HPLC分析显示，甜橙CPO中几乎所有的非挥发物都是PMFs，CPO的降血压作用应与PMFs的活性密切相关。

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