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家蚕分子伴侣BmHsp90及其辅分子伴侣BmCdc37对BmNPV增殖的影响研究

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第一章 文献综述

1.1 杆状病毒研究

1.2 Hsp90基因家族

1.3 Cdc37基因家族

第二章 引言

2.1 研究背景与目的意义

2.2 主要研究内容

2.3 技术路线

第三章 BmHsp90和BmCdc37基因的鉴定及表达模式分析

3.1 材料与方法

3.2结果与分析

3.3讨论

第四章 BmHsp90和BmCdc37的相互作用鉴定

4.1 材料与方法

4.2结果与分析

4.3讨论

第五章 BmHsp90和BmCdc37对BmNPV增殖的影响

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

第六章BmHsp90相互作用蛋白的鉴定

6.1 材料与方法

6.2 结果与分析

6.3讨论

第七章 结论与展望

7.1 结论

7.2 展望

论文创新点

参考文献

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致谢

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摘要

家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）是一种基因组为128kb左右的双链环状DNA病毒，它所引起的血液型脓病对养蚕业的危害极其严重，不仅降低了蚕丝的产量和质量，也不利于我国蚕丝业的稳定和发展。近年来，随着对 BmNPV研究的深入，发现宿主部分蛋白参与了病毒的增殖复制过程。Hsp90是热休克蛋白家族的一员，作为分子伴侣，在细胞内蛋白质构象的成熟中起重要作用，并且是许多病毒蛋白合成的重要参与者。Cdc37作为辅分子伴侣可以特异性地募集蛋白结合到 Hsp90形成分子伴侣复合体，参与维持蛋白的稳定和正常功能。
　　本研究主要内容包括：⑴克隆得到的BmHsp90基因全长2148bp，编码一个含有716个氨基酸残基的蛋白；BmCdc37基因全长1116bp，编码一个含有372个氨基酸残基的蛋白。通过多序列比对分析发现，BmHsp90包含N端保守的ATP结合结构域，以及起链接和二聚化作用的结构域；BmCdc37包含N端的客户蛋白结合结构域、中间结构域以及一个10.5kDa的C端结构域。系统发生分析表明，家蚕Hsp90归类于Hsp90大家族，家蚕Cdc37与同属于鳞翅目昆虫的柑橘凤蝶Cdc37亲缘关系较近。亚细胞定位分析发现，两蛋白均定位于细胞质中，且呈均匀分布。BmHsp90的热激诱导实验表明，在一定温度范围内该基因的转录水平会随着温度的升高而上升，符合热激蛋白的生物特性。通过组织表达模式分析发现，两者在精巢和卵巢中均有高表达，且在各组织中的表达趋势相近；通过 BmNPV诱导表达分析发现，两者基因的表达分布相似。以上实验皆暗示，两者在功能上可能存在一定的相关性。⑵构建了重组蛋白过表达质粒 pIZ/V5-His-BmHsp90-HA、pIZ/V5-His-BmCdc37-Flag、pBiFC-BmHsp90-VN、pBiFC-BmCdc37-VC。双荧光共定位和荧光双分子互补实验（BiFC）结果表明，BmHsp90蛋白与 BmCdc37蛋白在胞质中具有共定位，可能存在相互作用。进一步通过BmHsp90蛋白与BmCdc37蛋白的免疫共沉淀实验证实，BmHsp90蛋白与BmCdc37蛋白在家蚕细胞内具有相互作用。⑶在体外细胞水平，分别转染BmHsp90，BmCdc37过表达载体以及共同转染两基因过表达质粒48h后，感染绿色荧光标记的BmNPV，在感染病毒24h及48h时通过细胞流式仪检测感染率。实验结果表明，过表达家蚕Hsp90、Cdc37基因能促进BmNPV在细胞中的增殖，同时BmCdc37能增强BmHsp90促进病毒增殖的效果。在基因转录水平，通过相对荧光定量检测病毒关键基因VP39的表达量。实验结果同样表明，家蚕Hsp90、Cdc37能促进BmNPV在细胞中的增殖，同时BmCdc37蛋白能增强 BmHsp90促进病毒增殖的效果。在蛋白表达水平，通过 western blot检测 VP39蛋白，获得一致的结论。随后，在家蚕细胞中运用 CRISPR/Cas9技术敲除BmHsp90和BmCdc37，同样分别从细胞水平、基因转录水平和蛋白表达水平对BmNPV的增殖进行了探究。一系列实验结果均表明，通过CRISPR/Cas9技术敲除家蚕Hsp90、Cdc37能够抑制BmNPV在细胞中的增殖，同时抑制BmCdc37蛋白能增强BmHsp90抑制病毒增殖的效果。⑷以BmHsp90为诱饵蛋白通过免疫共沉淀的方法对BmHsp90的相互作用蛋白进行了筛选，鉴定到一个分子量为70kDa的BmGolga5蛋白以及61kDa的BmTbce蛋白。通过免疫荧光发现BmGolga5蛋白在细胞中定位于胞质，并且部分呈现点状分布；BmTbce蛋白在细胞中定位于胞质。最后通过双荧光共定位及免疫共沉淀实验再次验证了两种蛋白分别与 BmHsp90具有相互作用。根据 Golga5蛋白和Tbce蛋白相关的研究推测：家蚕Cdc37募集Tbce、Golga5蛋白到Hsp90进行折叠，维持其稳定，从而促进了微管的聚合、高尔基体上的逆向运输。病毒通过利用逆向运输使新合成的病毒蛋白逃脱被泛素化降解的命运，同时逃逸的病毒蛋白借助微管轨道被运输入核与病毒核酸进行组装，从而促进了病毒的增殖。

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