融合蛋白Adk-MEK1R4F在大肠杆菌中的表达及应用于ERK蛋白磷酸化的研究

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丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号转导通路主要是将细胞外的信号（如生长因子，细胞激素）传递到细胞内及核中从而调控多种细胞反应如生长，分化，炎症和凋亡。目前在哺乳类细胞中已发现存在着三条并行的 MAPKs信号通路,包括ERK（extracellular signal-regulated kinase）信号通路，JNK／SAPK信号通路和p38 MAPK信号通路。每一条信号通路均包括三个级联反应蛋白：MAPK，MAPK激酶，MAPK激酶激酶。目前研究得较为全面的是Ras/Raf/MEK/ERK信号通路。丝裂原活化蛋白激酶激酶1（MKK1或者MEK1）是该信号转导通路中的一个重要组成部分，由于其在调节细胞的增殖和分化中的重要作用，MEK1成为了癌症治疗的一个有吸引力的目标。其功能主要是介导下游底物 ERK1和 ERK2保守性苏氨酸和络氨酸位点的磷酸化。ERK蛋白的磷酸化激活是丝裂原活化的直接反应之一，且 ERK自身的磷酸化对 ERK蛋白在细胞核中的定位和癌细胞迁移中有重要作用。大多数蛋白激酶活性的激活源于其自身的磷酸化。体外实验中，上游激酶蛋白Mos、MEKK以及大多数的Raf家族蛋白均可以磷酸化MEK1激酶蛋白。然而只有Raf-1是其生理学上的上游激酶蛋白。Raf-1蛋白是由两个功能性不同的结构域组成，两个结构域为氨基端的调控结构域和羧基端的激酶结构域。当将其氨基端结构域敲除后从而变成了组成性激活的催化性结构域Raf-BXB。然而Raf-BXB也是可以激活MEK1蛋白的磷酸化。在本文的研究中，我们主要是运用MEK1的组成性活性形式MEK1R4F作为研究对象。
　　目前对于人源的 MEK1蛋白的研究主要是其表达，纯化以及其激酶特性的研究。然而在以前的研究报道中，MEK1的蛋白表达纯化在昆虫细胞系以及大肠杆菌中均有研究，但是其表达水平非常低也造成后续纯化非常困难，只可以纯化到少量的蛋白且纯度不高。本文主要研究了腺苷酸激酶蛋白作为一个标签蛋白，将其相对应的基因（Adk）通过重叠PCR的方法融合到MEK1R4F基因的N端，此标签蛋白融合后不仅可以增强 MEK1R4F在大肠杆菌中的表达水平，还可以促进该蛋白后续的纯化。研究报道，腺苷酸激酶（Adk）是一个重要的磷酸转移酶，其在活细胞从细菌到哺乳动物中均有表达，它在细胞的能量平衡和腺嘌呤核苷酸的代谢中起着重要的作用。源于大肠杆菌的腺苷酸激酶，其不仅在大肠杆菌中有高水平的表达，而且还可以将二磷酸腺苷转换成三磷酸腺苷和腺苷一磷酸。如此融合后的 Adk-MEK1R4F蛋白不仅在大肠杆菌中的表达水平大大增加，且通过Ni-NTA的亲和层析以及 QFF柱子的阴离子交换层析两步纯化可以得到95％纯度的蛋白。纯化得到的Adk-MEK1R4F融合蛋白不仅保留了其完整的磷酸化ERK蛋白激酶活性，而且可以利用除三磷酸腺苷之外的二磷酸腺苷作为能量介导ERK蛋白的磷酸化。并且在MEK1R4F利用二磷酸腺苷作为能量介导的ERK磷酸化反应中加入纯化得到的腺苷酸激酶蛋白可以磷酸化 ERK。同时我们还发现不管是体外还是体内的ERK磷酸化，Adk-MEK1R4F融合蛋白比非融合MEK1R4F蛋白激酶有更高的活性。因此可以利用此方法去纯化得到更多的磷酸化ERK蛋白。该方法也可以应用于其他重组蛋白的表达，以及其下游纯化。

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作者
杨芳;
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作者单位

西南大学;

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授予单位西南大学;
学科生物化学与分子生物学
授予学位硕士
导师姓名李洪涛;
年度 2017
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类蛋白质;基因工程（遗传工程）;
关键词
融合蛋白; 大肠杆菌; 丝裂原活化蛋白激酶; 信号转导通路; 磷酸化;

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