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氧化石墨烯放大荧光各向异性及其在生物分子检测中的应用研究

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第一章 选题依据

1.1研究意义

1.2研究现状

1.3存在的主要问题

1.4本研究的目标与拟解决的科学问题

1.5研究内容

第二章 新型氧化石墨烯放大荧光各向异性方法用于检测生物分子

2.1引言

2.2实验部分

2.3结果与讨论

2.4本章小结

第三章 核酸外切酶III辅助氧化石墨烯放大荧光各向异性方法用于蓖麻毒素B链的灵敏检测

3.1引言

3.2实验部分

3.3结果与讨论

3.4本章小结

第四章 无酶信号放大辅助氧化石墨烯增强荧光各向异性用于microRNA的灵敏检测

4.1引言

4.2实验部分

4.3结果与讨论

4.4本章小结

第五章全文总结及展望

5.1总结

5.2展望

参考文献

硕士期间科研成果

致谢

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摘要

近年来，荧光各向异性法被广泛用于生化分析及临床诊断中。荧光各向异性值与分子的体积和质量相关。由于多数分子的体积和质量相对较小，能引起的荧光各向异性变化非常微弱，因此检测灵敏度有待提高。纳米材料已经成功用于放大荧光各向异性信号，其中，氧化石墨烯相比于零维的球形纳米颗粒具有更大的比表面积和在溶液中更低的旋转速率，并且能特异性识别核酸单双链，因而成为优良的荧光各向异性信号增强剂。然而，氧化石墨烯增强荧光各向异性存在一定局限，一方面氧化石墨烯对荧光染料的荧光存在较大的猝灭作用，从而影响检测的准确度；另一方面若探针分子直接吸附在氧化石墨烯表面，加入靶物后，探针分子不易从氧化石墨烯上释放出来，从而影响检测灵敏度。鉴于此，本论文设计了新型氧化石墨烯增强荧光各向异性方法，并且结合信号放大策略，实现了一系列生物分子的分析检测。具体研究内容包括以下三个方面：
　　（1）设计了一种新型、通用、具有更高准确度和灵敏度的氧化石墨烯增强荧光各向异性策略。在本设计中，探针分子通过捕获DNA间接固定在氧化石墨烯上，从而增大了探针分子上荧光染料的荧光各向异性，加入靶物之后，探针分子从氧化石墨烯上释放出来，荧光各向异性值减小，通过测定加入靶物前后荧光各向异性值的变化实现了对单链DNA、腺苷和凝血酶的灵敏检测。该方法通过引进捕获DNA，降低了氧化石墨烯对荧光染料荧光的猝灭，从而提高了检测准确度；并且使荧光探针分子更易从氧化石墨烯上释放，提高了检测灵敏度。
　　（2）基于以上策略，进一步开发了核酸外切酶 III辅助氧化石墨烯放大荧光各向异性信号方法，并用于蓖麻毒素 B链的灵敏检测。该方法以核酸适配体作为识别单元，与传统的免疫检测蓖麻毒素方法比较具有简单、快速，成本低等优点。此外，我们使用核酸外切酶 III实现了循环放大信号，进一步提高了检测灵敏度。在该设计中，蓖麻毒素B链的核酸适配体和blocker序列部分杂交并且和磁珠相连，加入蓖麻毒素B链后，blocker从磁珠表面释放。游离的blocker能引起链置换反应和探针DNA杂交形成双链，从而使探针DNA从氧化石墨烯上释放，荧光各向异性降低。释放后的blocker-探针DNA双链在核酸外切酶III的作用下实现循环放大信号，即一个blocker链通过循环作用，可以消耗大量的探针DNA，使得荧光各向异性大大减小。通过降低的荧光各向异性信号实现了蓖麻毒素 B链的灵敏检测。实验结果表明，荧光各向异性变化值和蓖麻毒素 B链在浓度为1.0μg/mL–13.3μg/mL间呈现良好的线性关系，检测限为400 ng/mL。该检测限接近目前发展的免疫方法，比不使用核酸外切酶III时低22.5倍。通过改变相应的核酸适配体序列该方法还可实现检测其他靶物。
　　（3）利用无酶放大信号方法（靶物催化DNA发卡结构组装，CHA）辅助氧化石墨烯增强荧光各向异性建立了具有高灵敏度和高选择性的microRNA-21检测方案。探针DNA通过捕获DNA与氧化石墨烯间接相连，使其荧光各向异性增大。加入 microRNA-21后，引发 DNA发卡结构组装，形成无酶循环反应。同时，发卡结构组装体能通过链置换反应与探针DNA组成复合体，并使探针DNA从氧化石墨烯上释放，导致荧光各向异性值降低。通过降低的荧光各向异性信号实现了microRNA-21的灵敏检测。荧光各向异性降低值和 microRNA-21在浓度为0.1 nM-16 nM间呈现良好的线性关系，检测限为47 pM。该检测限比不使用CHA时低279倍。此外，与不使用CHA比较，该检测方法的选择性得到了明显提高。该方法实现了无酶循环放大信号，提高了检测灵敏度和选择性，克服了蛋白质酶放大信号的稳定性低、成本高等局限，并且完成了癌细胞内microRNA-21的灵敏检测，为临床诊断提供了一种快速简单的方法。
　　综上所述，在本研究中，我们提出了新型氧化石墨烯增强荧光各向异性策略，该策略己成功应用到一系列生物分子（核酸、蛋白质、腺苷）的分析检测中，提高了氧化石墨烯增强荧光各向异性检测方法的准确度和灵敏度。同时，我们结合循环放大信号策略，进一步提高了荧光各向异性检测方法的灵敏度和选择性，为危险品检测和疾病诊断提供了简单快速的方法。这些方法还具有普适性，通过适当替换探针，便能够应用于其他靶物的分析中。

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