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组蛋白变异体H2A.X在卵母细胞裂解液逆转化小鼠胎儿成纤维细胞(MEFs)成为诱导性多能干细胞(iPSC)中的作用研究

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第1章文献综述

1. 卵母细胞裂解液重编程体细胞的研究现状

1.1 体细胞重编程

1.2卵母细胞裂解液重编程体细胞为多能干细胞的研究现状

1.3影响卵母细胞裂解液重编程体细胞效率的因素

2. 组蛋白变异体的研究现状

2.1 H2A.X

2.2 H2A.Z

2.3 H2A.Bbd

2.4 MacroH2A

3.结语与展望

第2章试验研究

试验1小鼠卵母细胞裂解液逆转化MEFs为iPSCs的研究

1. 材料

2.方法

3. 结果与分析

4. 讨论

试验2组蛋白变异体H2A.X蛋白的重组表达及分离纯化

1. 材料

2. 方法

3. 结果与分析

4. 讨论

试验3不同分化阶段小鼠细胞变异体H2A.X蛋白含量的测定

1. 材料

2. 方法

3. 结果与分析

4. 讨论

试验4H2A.X对小鼠卵母细胞裂解液逆转化MEFs为iPSCs效率的影响

1. 材料

2. 方法

3. 结果与分析

4. 讨论

结论

参考文献

附录：缩略词表

致谢

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摘要

卵母细胞通过一定的方法裂解后，细胞内能够维持干细胞多能性的一些关键蛋白和信息分子如细胞因子、转录调控因子等被释放出来。小鼠胎儿成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts，MEFs）经过渗透化处理后，细胞膜的通透性增加，这些因子就可能进入体细胞，促使其发生内源性的染色质结构重建、DNA去甲基化、组蛋白乙酰化、印记基因表达、维持多能性的必需基因的活化等重编程过程，从而将已分化的体细胞逆转成为诱导性多能干细胞（Induced pleuripotentstem cells，iPSCs）的状态。由于核小体的基本结构是由核心组蛋白八聚体构成的，核小体的紧密程度直接影响了DNA解螺旋及基因的活化，进而影响到了细胞重编程的进行。组蛋白拥有众多变异体，尤其是H2A家族变异体最为丰富，人工替换核小体中的典型组蛋白H2A能够起到调节细胞生理功能的作用。
　　根据以上基因活化原理和核小体组蛋白修饰影响基因表达及活化的研究结果，本研究在运用卵母细胞裂解物诱导已分化体细胞基因组重编程、促使其逆分化为多能干细胞的试验中，通过进一步添加组蛋白变异体H2A.X蛋白、DNA甲基化抑制剂5-杂氮-2'-脱氧胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dC）和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（Trichostatin A，TSA）三种物质组合，研究被诱导体细胞重编程发生的原理，探索其提高重编程效率、缩短重编程时间和简化重编程试验方法的可能途径。研究试验如下：
　　试验一小鼠卵母细胞裂解液逆转化MEFs为iPSCs的研究
　　本研究通过体外获取小鼠卵母细胞，制备卵母细胞裂解液，利用其中含有的重编程因子，将不同浓度的卵母细胞裂解液（20个/20μl、30个/20μl、40个/20μl、50个/20μl和60个/20μl）与经过适宜浓度链球菌溶血素O（streptolysin O，SLO）（25U）渗透化处理的第三代MEFs共孵育，以研究不同浓度的卵母细胞裂解液对MEFs重编程的影响。然后，通过在卵母细胞裂解液重编程中添加单一的表观遗传修饰因子TSA或5-Aza-dC和同时添加TSA、5-Aza-dC两种因子，观察不同处理之间重编程效率的差异，旨在优化卵母细胞裂解液重编程体细胞的体系，提高重编程效率，减少重编程时间。结果表明：当卵母细胞裂解液浓度为40个/20μl、50个/20μl和60个/20μl时，iPSCs的集落数（分别为24±1.25个、23.88±0.47个和22±1.63个）极显著高于20个/20μl和30个/20μl处理组的集落数（分别为11.33±1.7个和17±0.82个）（P＜0.01），而卵母细胞裂解液浓度为40个/20μl、50个/20μl以及60个/20μl时所形成的iPSCs集落数差异不显著（P＞0.05）；当在卵母细胞裂解液重编程基础上同时添加了TSA和5-Aza-dC时，iPSCs集落数（35.88±0.77个）显著高于只添加一种表观遗传修饰因子TSA或5-Aza-dC的集落数（分别为29±1.45个、30±0.98个）（P＜0.05）。因此，在卵母细胞裂解液浓度为40个/20μl、50个/20μl和60个/20μl重编程效率差异不大的情况下，宜采用40个/20μl卵母细胞裂解液重编程MEFs，同时，为了提高重编程效率，缩短时间，添加表观遗传修饰因子TSA和5-Aza-dC能更大程度的提高卵母细胞裂解液重编程的效率。
　　试验二组蛋白变异体H2A.X蛋白的重组表达及分离纯化
　　本试验通过构建小鼠组蛋白变异体H2A.X重组质粒，利用大肠杆菌系统对重组质粒进行扩增，并对重组质粒进行分离及鉴定，以扩大质粒DNA量为转染HEK-293T提供大量的H2A.X重组质粒。然后，运用抽提的重组质粒DNA转染HEK-293T细胞，采用含有效浓度为800ng/ml的新霉素（Genet ic in，G418）筛选阳性克隆细胞，并对阳性克隆进行增殖培养，以获取大量转染质粒的克隆细胞为后续提取大量变异体H2A.X蛋白提供充足的细胞来源。最后，利用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒（可溶性蛋白）对变异体蛋白H2A.X进行分离纯化，并采用SDS-PAGE对分离的蛋白质进行纯度分析，旨在分离纯化出大量优质的变异体H2A.X蛋白。结果表明：抽提的重组质粒DNA浓度为300ng/μl，电泳结果显示两条带，其中4.7Kbp为质粒，440bp为目的基因H2A.X；经过G418筛选15天后稳定转染的阳性克隆细胞贴壁率达90％以上；经分离纯化的变异体 H2A.X蛋白的浓度为38.96μg/ml，SDS-PAGE电泳结果显示蛋白样品纯度高，大小为16.7kD。
　　试验三不同分化阶段小鼠细胞变异体H2A.X蛋白含量的测定
　　本试验利用酶联免疫技术（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）对不同分化阶段的细胞，包括小鼠卵母细胞、MEFs、受精卵、2-细胞期胚胎、4-细胞期胚胎、8-细胞期胚胎、桑椹胚、囊胚胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）和iPSCs进行组蛋白变异体含量的测定，旨在探究出不同分化阶段细胞的变异体含量变化趋势。结果表明：不同阶段的细胞变异体蛋白的含量分别为MEFs（40个/20μl）为15.8±0.93ng，卵母细胞裂解液（40个/20μl）为57±1.64 ng，受精卵（40个/20μl）为87.2±1.45ng，2-细胞期胚胎（20个/20μl）为73.13±1.24ng，4-细胞期胚胎（10个/20μl）为66.2±1.76ng，8-细胞期胚胎（5个/20μl）为60.5±2.12ng，桑椹胚内的细胞（40个/20μl）为65.2±1.78ng，囊胚内的细胞（40个/20μl）为66.4±1.15ng，ESCs（40个/20μl）含量为68.23±1.54ng，iPSCs（40个/20μl）为60±1.83ng。试验数据表明：MEFs在重编程前组蛋白变异体H2A.X蛋白含量低，重编程后形成的iPSCs变异体蛋白含量高；早期胚胎阶段，组蛋白变异体H2A.X蛋白总体呈下降趋势。因此，细胞基因组 DNA的活动性随细胞内组蛋白变异体H2A.X含量的升高而增加。
　　试验四H2A.X对小鼠卵母细胞裂解液逆转化MEFs为iPSCs效率的影响
　　本研究通过在卵母细胞裂解液重编程MEFs的过程中单一添加不同浓度的变异体H2A.X（0ng/20μl、30ng/20μl、60ng/20μl、90ng/20μl和120ng/20μl），探究添加外源性组蛋白变异体H2A.X蛋白是否对卵母细胞裂解液重编程的过程具有促进作用；再通过添加H2A.X蛋白、TSA、5-Aza-dC三种物质到卵母细胞裂解液中观察重编程MEFs为iPSCs的情况，旨在探讨更快、更安全的卵母细胞裂解液重编程体细胞的方法。最后，通过ELISA检测H2A.X蛋白处理过的MEFs、未经H2A.X蛋白处理的MEFs、H2A.X处理后所得iPSCs、未经H2A.X蛋白处理所得iPSCs中组蛋白变异体H2A.X蛋白水平的变化，进一步探讨组蛋白变异体是如何影响染色质结构继而影响重编程的效率。结果表明：当添加变异体H2A.X蛋白的浓度为60ng/20μl，90ng/20μl和120ng/20μl时，iPSCs集落数（分别为35.67±0.94个、34±0.82个和32.33±1.25个）极显著高于其他处理组（分别为24.63±1.25和28.67±1.70）（P＜0.01），添加60ng/20μlH2A.X蛋白所得iPSCs集落数最高；同时加入变异体H2A.X蛋白、TSA和5-Aza-dC，形成的iPSCs集落数（45±0.62个）极显著高于只添加一种或任意两种小分子物质集落数（34.67±0.88个，39±1.10个、41.27±1.4个）（P＜0.01）；经变异体H2A.X蛋白处理的MEFs的变异体H2A.X蛋白含量为20.8±1.33，极显著高于未经变异体H2A.X蛋白处理MEFs的15.8±0.93（P＜0.01），形成的iPSCs的变异体 H2A.X蛋白含量差异不明显（P＞0.05）。因此，宜采用在卵母细胞裂解液中添加60ng/20μlH2A.X蛋白、50ng/mL TSA和2μg/mL5-Aza-dC重编程MEFs为iPSCs，经过组蛋白变异体H2A.X蛋白处理后，MEFs的变异体H2A.X蛋白含量明显增加，并且也显著提高了MEFs的重编程效率。
　　结论：宜采用40个/20μl的卵母细胞浓度进行卵母细胞裂解液的重编程，为了提高其重编程的效率，宜添加表观遗传修饰因子：TSA和5-Aza-dC；在重编程逆转化前后，MEFs中组蛋白变异体H2A.X蛋白的含量变化明显，经过变异体H2A.X处理后，其含量明显增加，逆转化效率也得到提高，表明组蛋白H2A.X含量的高低能够影响重编程的效率。组蛋白变异体H2A.X蛋白在早期胚胎发育的过程中变化并不明显，但总体都是高于卵母细胞和MEFs，低于受精卵，表明细胞基因组DNA的活动性随细胞内组蛋白变异体H2A.X含量的升高而增加；组蛋白变异体H2A.X蛋白能够提高卵母细胞裂解液逆转化MEFs形成iPSCs的效率，而且添加DNA甲基化抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂均有助于组蛋白变异体提高卵母细胞裂解物重编程MEFs为iPSCs的能力。

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