家蚕性别决定重要因子Masc蛋白的性质研究

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家蚕（bombyx mori）作为一种鳞翅目昆虫，可作为模式生物研究其生命活动的调节机制，产出的丝对农业生产具有重要经济效益，同时也是开发新一代生物反应器和新型昆虫产业的经典材料。农耕立国，养蚕与种桑一直是我国古代至近代农业的重要组成部分，我国的人工养蚕史已经有5000多年，丝绸之路也成为中外经济、文化交流的重要通道。2003年底，我国率先完成了家蚕基因组框架图的绘制工作，获得了大量重要的家蚕基因组信息，这使我国在家蚕功能基因组研究方面处于先进和有利地位。通过家蚕这一重要模式生物的功能基因组研究，将促进丝绸产业的发展、拉动农林相关学科发展、促进以家蚕为代表的昆虫产业开发、并推进生命科学基础研究的进程。
　　而对于家蚕性别的研究无论在生产上还是在害虫的防治上都具有重要意义。据研究报道，由于雄蚕不需要参与产卵过程，它们的产丝量要远远大于雌蚕。因此在生产中调节家蚕性别比例，使雄蚕的数量增加，可以大大提高产丝量，对蚕丝的产业化生产具有重要意义。家蚕作为一种模式昆虫，研究其性别调控可以通过控制雄蚕的数量进而控制家蚕的繁殖量，继而达到鳞翅目害虫防治的目的。
　　从分子生物学水平研究家蚕性别决定的机制可以为农业生产提供基础理论和参考。因此，对于家蚕性别决定的基因研究就显得尤为重要。到目前为止，很多性别相关的基因被鉴定出来，其中对性别决定起主导作用的基因为Bmdsx基因。研究Bmdsx基因与其它基因的相互作用对进一步探究家蚕的性别调控具有推动作用。其中，Masc在2014年被发现，该基因可以与家蚕性别调控初始基因Fem相互作用，调控着下游Bmdsx基因的选择性剪切，从而决定家蚕的性别分化。尽管研究人员已经知道Masc在家蚕性别决定过程中起着重要作用，然而目前对Masc蛋白本身的性质却报道甚少。
　　因此，我们选取Masc作为研究对象，对其进行了生物信息学分析，并克隆包含两个CCCH-type锌指结构和含有部分卷曲结构的domain区域并进行了蛋白的原核表达及纯化；进而对该上清活性蛋白进行二级结构分析，并在这两个蛋白区段中选取特异性较强的功能区制备了多克隆抗体；利用RT-PCR和荧光定量PCR技术探究Masc在家蚕各组织的表达特征，同时对其生殖腺的蛋白表达水平进行检测；然后又对其在细胞及组织的表达进行定位；最后通过IP及质谱鉴定探究Masc与其它蛋白的相互作用。获得的主要结果如下：
　　1、Masc的生物信息学分析；
　　根据文献报道，家蚕Masc在NCBI中的登录号为AB840788.1。经分析，Masc的mRNA全长为2075 bp，其中CDS序列长度为1767 bp，5’非翻译区（5’UTR）的长度为146 bp，3’非翻译区（3’UTR）的长度为162 bp。Masc基因定位于Z染色体上。
　　通过生物信息学分析，结果显示其编码588个氨基酸；蛋白质理论分子量为64.71 kD，等电点为9.69，属于碱性蛋白。同源性检索结果显示其与大红斑蝶的同源性最高，但与其它物种的同源性都较低。采用SMART程序进行结构域预测，结果显示Masc蛋白第48到73和第79到105区段分别为两个含有CCCH-type的锌指结构域。
　　利用家蚕全基因组芯片表达谱数据分析显示，该基因的芯片探针号为sw18123；芯片表达谱数据显示Masc在精巢和卵巢中具有表达信号，其中精巢的信号值要显著大于卵巢。
　　2、Masc的domain区的克隆、原核表达、蛋白纯化、二级结构分析及抗体制备；
　　取家蚕5龄3天的精巢进行研磨并抽提总RNA，将其反转为cDNA作为模板。对Masc的CDS序列的domain区进行序列分析，选取第135 bp到435bp、第900 bp到1305 bp的两个区域分别设为domain1区和domain2区，并设计引物。以cDNA为模板，利用自己设计的引物进行PCR，最终克隆得到两个区域的基因片段，并通过琼脂糖凝胶电泳及胶回收的方式进行片段回收，将回收到的片段双酶切并用T4连接酶将其与pET-28a的表达载体相连获得重组载体，再导入到大肠杆菌感受态Transetta菌株中，优化表达条件并原核表达获得蛋白。
　　对domain1区表达的蛋白进行凝胶过滤层析的纯化及圆二色谱的测定，圆二色谱法分析可得Masc的domain1区表达的蛋白含有丰富的β-折叠的结构，这与其具有锌指结构的结果相符。考虑到domain2区段的特异性较好，故domain2区表达的蛋白送入公司制备抗体，获得了0.62mg/mL的多克隆抗体，效价为1:500000，通过western blotting的检测结果显示该抗体的单一性良好，可以进行后续实验。
　　3、Masc在RNA及蛋白水平的组织表达特征分析；
　　采用RT-PCR、荧光定量PCR进行Masc各组织间表达水平的检测，结果显示Masc在家蚕5龄3天的生殖腺中表达，其中在精巢中高量表达，而在卵巢中也能检测到其表达，但表达量较低。生殖腺的蛋白定量结果也显示，Masc蛋白在生殖腺中的精巢表达量较高，这个结果与RNA水平的表达结果一致。这些结果说明Masc在生殖腺中可能发挥着重要作用。
　　4、Masc在细胞及组织的表达定位分析；
　　为了进一步研究Masc的性质，本论文进行了Masc的表达定位研究。首先，将Masc的全长CDS进行克隆并在N端加入Myc融合标签，然后连接到真核表达载体1180[Hrs1000-BmAct4-LUC-Ser1PA]上，获得重组真核表达载体1180[Hrs1000-BmAct4-Myc-Masc-LUC-Ser1PA]，转染BmE细胞中进行表达，采用Myc标签抗体进行杂交。结果显示，Masc在BmE细胞中主要定位于细胞质。为了进一步确认亚细胞定位结果，我们采用Masc抗体进行杂交，结果显示Masc蛋白在BmE的细胞质中同样具有很强的信号。
　　然后，我们进行了Masc蛋白在生殖腺组织的表达情况研究。免疫荧光实验结果显示，Masc主要在结缔组织层、精原细胞、生精囊和精子束中均有表达。其中，该蛋白在精子束中主要定位在细胞核；而在生精囊中主要定位在细胞质；在结缔组织层中主要定位在细胞质。这些结果暗示Masc在精巢中可能发挥着多种功能。
　　5、Masc与其它蛋白的相互作用分析；
　　为了获得新的与Masc相互作用的蛋白，本论文进行了Masc的免疫沉淀实验。Masc-IP实验及质谱鉴定的结果显示，一共鉴定了185种蛋白，分别在66个蛋白组中。其中与家蚕性别决定相关的蛋白有2个，分别是Ago3和Siwi蛋白。这些结果暗示Masc蛋白可能同参与ping-pong机制并含有Piwi功能域的Ago3和Siwi蛋白结合，参与性别调控的过程。下一步我们将通过Co-IP实验验证Masc与Ago3及Siwi相互作用结果。

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作者
王鹤;
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作者单位

西南大学;

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授予单位西南大学;
学科生物化学与分子生物学
授予学位硕士
导师姓名查幸福;
年度 2016
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类蚕体遗传;
关键词
家蚕; 性别调控; Masc蛋白; Bmdsx基因; 生物信息学;

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