2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的作用及机制研究

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[目的]
　　课题组的前期研究结果发现中药何首乌具有抗骨质疏松的作用，其机制与促进骨形成有关，但机制不明。骨髓间充质干细胞是一类具有多向分化潜能及自我更新能力的成体组织干细胞，促进骨髓间充质干细胞成骨分化是促骨形成药的作用机制之一。2,3,5,4-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(tetrahydroxy stilbenegluco side，TSG)是中药何首乌的特征性物质，本研究通过观察TSG对大鼠骨髓间充质干细胞(Marrow stromal stem cells，MSCs)碱性磷酸酶和骨钙素表达的影响，以阐明其对MSCs成骨分化的作用，以及作用的时效和量效关系;观察TSG对Wnt/β-catenin信号通路相关基因和蛋白表达的影响，以阐明其是否通过调节Wnt信号通路发挥促进MSCs成骨分化的作用，由此探讨TSG对干细胞分化方向的调节作用及作用机制，并为下一步何首乌抗骨质疏松有效成分的筛选提供实验依据。
　　 [方法]
　　 1全骨髓培养法分离纯化BMSCs，流式细胞仪鉴定细胞表面抗原，油红染色法观察判断是否成功诱导MSCs向脂肪细胞方向分化。碱性磷酸酶染色法与茜素红染色法观察判断是否成功诱导MSCs向成骨细胞方向分化。
　　 2应用MTT法检测TSG对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响。对硝基苯磷酸盐法和双抗体两步夹心酶联免疫吸附法检测TSG对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶和骨钙素的影响，实时荧光定量PCR法检测TSG对成骨分化相关基因Runx2、Col1a1 mRNA表达的影响，以观察TSG对MSCs增殖和成骨分化能力的作用，以及这种作用的时效和量效关系。
　　 3免疫印迹法和实时荧光定量PCR法观察TSG对Wnt/β-catenin信号通路关键靶点蛋白Dickkopf-1、Gsk3β、β-catenin以及基因Gsk3β、β-catenin mRNA表达，以观察TSG对大鼠骨髓间充质干细胞Wnt/β-catenin信号通路的调节作用。
　　 [结果]
　　 1全骨髓贴壁法纯化后得到形态均一，呈长梭形的细胞，其间存在间充质干细胞，经不同诱导条件，能向成骨细胞和脂肪细胞方向分化，未经诱导的细胞局部出现钙化现象，流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29和CD90呈阳性，CD45呈阴性。
　　 210-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L TSG作用24、48、72小时，细胞数量均比对照组多，其中10-4mol/L TSG作用48和72小时、104mol/L TSG作用72小时能促进BMSCs增殖(P＜0.05)。TSG还能促进胞浆内碱性磷酸酶表达，10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L TSG作用3天、5天、7天能升高BMSCs胞浆内碱性磷酸酶表达，差异有统计学意义(P＜0.05)，而且这种作用在第5天达到高峰。10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L TSG作用7天可使骨钙素含量升高(P＜0.05)。10-5mol/L、10-6mol/L的TSG处理BMSCs5天可上调成骨分化基因Runx2和Col1a1的mRNA的表达(P＜0.05)。
　　 310-5mol/L、10-6mol/L的TSG处理BMSCs5天，DKK1、β-catenin和GSK-3β蛋白表达升高，β-catenin和GSK3βmRNA表达升高。
　　 [结论]
　　 1 TSG可促进大鼠骨髓基质干细胞增殖，同时促进其向成骨细胞方向分化，促进MSCs表达碱性磷酸酶刺激骨钙素的分泌，上调成骨分化基因Runx2和Col1a1的mRNA的表达。
　　 2 TSG促进大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞方向分化的作用可能与调控Wnt/β-catenin信号通路有关。

著录项

作者
郑亮;
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作者单位

广东医学院;

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授予单位广东医学院;
学科药理学
授予学位硕士
导师姓名刘钰瑜,崔燎;
年度 2013
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类中药实验药理;中医骨伤科;
关键词
葡萄糖苷; 骨髓间充质干细胞; Wnt/β-catenin信号通路; 成骨分化; 碱性磷酸酶; 骨钙素;

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