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西南地区本地黄牛及其杂交牛CAST、H-FABP、MyoD1基因部分编码区多态性分析

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第1章文献综述

1.1 Calpain家族基因的研究进展

1.1.1钙蛋白酶系统的概况

1.1.2 Calpain家族与Ca2+的关系

1.1.3 Calpain家族的分布

1.1.4 Calpain对肌肉嫩化机理

1.1.5牛Calpain家族的研究现状

1.1.6牛CAST基因研究现状

1.1.7 Calpain家族的研究前景

1.2脂肪酸结合蛋白(FABP)家族基因的研究进展

1.2.1 FABP家族的概述

1.2.2 FABPs的结构特点

1.2.3 FABPs的表达调控

1.2.4 H-FABP的研究进展

1.2.5 H-FABP的多态性的研究

1.2.6关于牛H-FABP基因研究前景

1.3 MyoD家族基因

1.3.1 MyoD家族的概述

1.3.2 MyoD家族的结构特点

1.3.3 MyoD1基因的研究进展

1.3.4 MyoD家族各成员在肌肉发育中的作用

1.3.5 MyoD1基因多态性的研究及其与生产性状关联

1.3.6 MyoD1基因的研究前景

1.4分子标记技术研究进展

1.4.1限制性片段长度多态性技术

1.4.2微卫星标记技术

1.4.3 单核苷酸多态性

1.5 PCR-SSCP基本原理与特点

第2章材料方法

2.1试验材料

2.1.1试验动物来源

2.1.2样品采集

2.1.3试验菌株及载体

2.1.4试验主要试剂

2.1.5常用溶液及试剂配制

2.2主要仪器

2.3试验方法

2.3.1基因组DNA的提取

2.3.2 DNA浓度和纯度的检测

2.3.3 PCR引物的设计与合成

2.3.4 PCR反应体系及其条件

2.3.5 PCR产物的检测

2.3.6产物的SSCP分析

2.3.7 PCR扩增产物的回收与纯化

2.3.8感受态细胞的制备

2.3.9连接反应

2.3.10转化

2.3.11菌液PCR鉴定阳性克隆、测序

2.3.12统系分析方法

第3章结果与分析

3.1耳组织基因组DNA的抽提结果

3.2 PCR-SSCP结果

3.2.1 CAST基因PCR-SSCP结果

3.2.2 H-FABP基因PCR-SSCP结果

3.2.3 MyoD1基因PCR-SSCP结果

3.3各基因型的测序结果及序列比对

3.3.1 CAST基因引物C1、C2、C3的测序结果

3.3.2 H-FABP基因引物H1、H2的测序结果

3.3.3 MyoD基因引物M1、M2的测序结果

3.4基因多态位点群体遗传学分析

3.4.1六个牛群体基因型、等位基因频率分析

3.4.2各基因遗传特性分析

3.4.3 Hardy-Weinberg平衡的检验

第4章讨论

4.1实验材料的选择和DNA的提取

4.1.1实验材料的选择

4.1.2 DNA的提取

4.2 PCR-SSCP的影响因素

4.2.1 PCR的影响因素

4.2.2 SSCP的影响因素

4.3突变位点

4.3.1 CAST基因引物C1、C2、C3扩增片段的突变位点

4.3.2 H-FABP基因引物H1、H2扩增片段的突变位点

4.3.3 MyoD1基因引物M1、M2扩增片段的突变位点

4.4 CAST基因、H-FABP和:MyoD1基因的多态性分析

4.4.1 CAST基因的多态性分析

4.4.2 H-FABP基因的多态性分析

4.4.3 MyoD1基因的多态性分析

4.5 CAST基因、H-FABP和MyoDl基因多态性的研究前景

4.5.1 CAST基因的多态性与生产性状的关联

4.5.2 H-FABP基因的多态性与生产性状的关联

4.5.3 MyoD1基因的多态性与生产性状的关联

第5章结论

参考文献

致谢

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摘要

钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin,CAST)是一种内源性的、需Ca2+激活的钙蛋白酶抑制剂,可抑制肌肉内蛋白质降解,降低肌细胞生长速度;屠宰后可抑制钙蛋白酶的活性。研究表明,CAST基因的产物显著影响肉的嫩度。心脏脂肪酸结合蛋白(Heart—Fatty Acid Binding Protein,H—FABP)基因的作用是将脂肪酸从细胞膜上运送到脂肪酸氧化和甘油三脂及磷脂的合成位置,H—FABP基因的遗传变异与肌内脂肪(Intramuscular Fat,IMF)含量存在相关性。生肌决定因子(Myogenic Detemination Gene,MyoD)基因不仅可促使静止期的肌卫星细胞向成肌细胞转化,而且能把许多种类型细胞(如成纤维细胞、脂肪细胞等)转化为成肌细胞,并可促进成肌细胞进一步融和、分化为成熟的肌纤维,在成肌过程中起主导作用。 本研究利用应用聚合酶链式反应—单链构象多态性(Polymerase Chain Reaction—SingleStrand Conformation Polymorphism,PCR—SSCP)技术和克隆测序方法对巴山黄牛、盘江黄牛、重庆山地黄牛、西杂牛、红杂牛、昭通黄牛的CAST、H—FABP、MyoD1基因多态性和遗传效应进行研究,以期为牛肉品质的分子标记辅助选择提供基础素材。 在CAST基因引物C1扩增片段中检测出2种基因型。在引物C2扩增片段中,由148位T→C、第159位C→A和第191位A→G和位于内含子中的第42位T→C和第68-70位的插入片段形成多态,C1为优势基因,六个牛群体中昭通黄牛处于中度多态,其他群体都是低度多态。序列比对发现在第148位点突变使酪氨酸→丝氨酸,第191位A→G引起丙氨酸→苏氨酸,此位点可以作为肉品质的侯选基因进一步研究;引物C3的扩增片段中,由位于外显子第27位G→A、第124-127位点缺失片段和位于内含子第182位G→A、第251位C→G形成多态,在4个地方群体牛中是F1为优势基因,2个杂交群体中是E1为优势基因,这个可能是人工选择引起的差异,六个牛群的PIC都处于中度多态,而且在该位点各个牛群体都处于Hardy—Weinberg平衡。在序列对比中发现在第27位点突变中G→A,使半胱氨酸→丙氨酸。此位点是否可以作为肉品质基因的侯选基因需要进一步研究。 对H—FABP基因引物H1扩增片段进行SSCP只发现单一条带,说明没有多态性。在引物H2扩增片段中出现3个等位基因,但只有3种基因型,此位点多态信息含量(PolymorphismInformation Content,PIC)除重庆山地黄牛处于中度多态,其他都是低度多态。 在MyoD1基因的引物M1扩增片段中,由位于外显子第49位C→G、第207位A→G形成多态,A3为优势基因,六个群体牛的PIC都是处于中度多态,测序结果和MyoD1基因的参考序列比对,发现第207位的突变使丝氨酸→甘氨酸。此位点是否可以作为肉品质基因的侯选基因需要进一步研究。

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