赤拟谷盗细胞色素P450 CYP345D3 cDNA基因克隆与序列分析

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第一章文献综述

1赤拟谷盗

1.1赤拟谷盗的发生与危害

1.2赤拟谷盗的抗性问题

2细胞色素P450

2.1细胞色素P450概述

2.2细胞色素P450的命名

2.3细胞色素P450的分布

2.4细胞色素P450的多样性

2.5细胞色素P450的结构特征

2.6细胞色素P450的功能

2.7昆虫细胞色素P450与害虫抗药性

2.8细胞色素P450介导的昆虫抗药性的分子基础

3 P450基因克隆策略

3.1分离纯化P450蛋白，制备抗体以筛选cDNA表达文库

3.2纯化P450蛋白，测定部分氨基酸序列，反推导成核苷酸序列设计简并引物筛选

3.3用已知的昆虫P450基因为探针筛选

3.4 PCR和RT-PCR克隆策略

3.5利用RACE方法克隆全长P450基因

3.6利用已完成全基因组测序物种基因组序列预测P450基因并设计引物克隆全长基因

第二章赤拟谷盗细胞色素P450基因片段的克隆

1试验材料

1.1饲料的处理与配制

1.2供试昆虫及饲养条件

1.3主要使用试剂

1.4主要使用仪器

1.5培养基的制备

1.6常用储备液及抽提液的制备

2赤拟谷盗P450 cDNA第一链的合成

2.1总RNA提取

2.2 RNA反转录

2.3 P450基因片断的扩增

2.4目的片段的克隆和测序

3结果与分析

3.1赤拟谷盗总RNA的提取

3.2 P450基因片断扩增结果

3.3 P450基因片段序列分析

4讨论

第三章赤拟谷盗P450 cDNA3’端序列的克隆及分析

1试验材料

2赤拟谷盗P450 cDNA的3’RACE

2.1赤拟谷盗总RNA的提取

2.2 3'RACE特异引物设计

2.3赤拟谷盗P450基因cDNA 3’端序列的扩增

3赤拟谷盗P450 cDNA 3’端序列分析

4讨论

第四章赤拟谷盗P450 cDNA5'端序列的克隆及分析

1试验材料

2赤拟谷盗P450 cDNA的5’RACE

2.1赤拟谷盗总RNA的提取

2.2 5'RACE特异引物设计

2.3扩增P450cDNA5’端序列第一链cDNA的合成(5'-RACE-Ready cDNA)

2.4 cDNA 5’末端的快速扩增

2.5 P450 cDNA5’端扩增片段电泳图

3结果与分析

3.1片段13的5’端的结果与分析

3.2片段14的5’端的结果与分析

3.3片段15的5’端的结果与分析

4讨论

第五章赤拟谷盗CYP345D3 cDNA全长的扩增

1材料与方法

2结果与分析

2.1赤拟谷盗P450 cDNA全长扩增结果

2.2 CYP345D3核苷酸及其ORF推导的氨基酸序列的基本信息

2.3同源性分析

2.4 CYP345D3与其他昆虫的P450氨基酸序列比对分析

2.5 CYP345D3的分子进化树

2.6 CYP345D3的蛋白同源模拟

3讨论

4研究展望

参考文献

附录

致谢