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间充质干细胞移植修复炎症性肠组织过程中差异基因筛选

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前 言

材料与方法

1．实验材料

2．方法

结 果

1．MSCs细胞形态及增殖特性

2．动物模型结果

3. 细胞内总RNA定量和完整性鉴定

4. 基因筛选结果

5. qRT-PCR验证Atoh1、Olfm4、Plaur基因的表达

讨 论

1.MSCs治疗IBD

2.基因芯片揭示MSCs修复炎症性肠组织的相关基因

3. Atoh1在MSCs移植修复炎症性肠组织的表达和意义

4. Olfm4在MSCs移植修复炎症性肠组织的表达和意义

5. Plaur在MSCs移植修复炎症性肠组织的表达和意义

6．总结和创新点

7.不足与期望

结 论

参考文献

综 述

致谢

声明

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摘要

研究背景：
　　炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn's disease,CD),是一组反复发作的慢性炎症性肠道疾病,他们共同表现为肠粘膜炎症,相关肠癌发病率较高。目前的治疗方法包括水杨酸类、肾上腺皮质激素、免疫抑制剂、抗生素等,虽然可以暂时缓解症状,但总的说来疗效欠佳,病情易复发,多年迁延不愈。近年来,很多研究提示间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSCs)可向内胚层肠粘膜细胞分化,MSCs移植对IBD有较好的疗效。我们前期实验研究已证实MSCs可定植于肠炎症损伤区域,具有上皮细胞形态。但MSCs如何修复炎症性肠组织,哪些基因在修复过程中发挥了作用,哪些基因在MSCs分化为肠上皮细胞过程起作用等问题,目前还不完全清楚。基因芯片技术具有高通量、快速、灵敏、平行性高的特点,可获得多个样本基因表达差异情况,已广泛用于各种疾病的研究。本实验对正常大鼠大肠组织和接受MSCs移植的IBD大鼠的大肠组织进行cDNA基因芯片分析,探讨MSCs治疗IBD中修复炎症性肠组织相关的差异表达基因,并用荧光定量PCR(qRT-PCR)进一步验证与干细胞分化相关基因表达的结果。
　　目的：
　　研究MSC移植修复大鼠炎症性大肠组织差异基因表达情况,寻找MSCs修复炎症性肠组织相关基因,并从中筛选出可能与MSCs跨系分化为肠上皮细胞相关的基因,用qRT-PCR进一步验证其表达,揭示其在MSCs跨系分化修复炎症性肠上皮的作用。
　　方法：
　　1.IBD模型大鼠造模方法及MSCs细胞移植:用20mgTNBS的50％乙醇溶液1.0ml,灌肠制作IBD大鼠模型,尾静脉注射法进行MSCs移植。
　　2.实验分为4组:MSC细胞对照组(细胞对照组):标本为MSCs细胞;正常组织对照组(正常对照组):标本为正常大鼠大肠组织(n=3);IBD模型组(IBD组):标本为IBD大鼠模型的大肠组织(n=9)和MSCs移植治疗组(MSCs治疗组):标本为MSCs移植后的大肠组织(n=9)。
　　3.病理切片及病理学观察:观察肠道黏膜大体形态,取病变最明显处组织用4%甲醛溶液固定,常规制片,HE染色,普通光镜及荧光显微镜下观察。
　　4.全基因组表达谱芯片及差异基因筛选:对MSCs治疗组及正常对照组大肠组织各两例提取大肠组织总RNA,逆转录成双链cDNA,然后用Axon Gene Pix 400B基因芯片扫描仪扫描,将数据信息导入Nimble Scan v2.6软件,取P<0.05,FC>2为条件筛选差异基因。
　　5.从差异基因中挑选与干细胞分化相关的Atoh1、Olfm4和Plaur基因,qRT-PCR进一步验证其表达。
　　6.统计学处理
　　使用SPSS13.0软件进行数据处理,各实验组数据均采用`c±s表示,满足正态分布或经转换后满足正态分布的计量资料组间比较使用单因素方差分析法进行各组间均数的比较,Bonferroni法分析组间均数两两比较的结果,显著性水平为P<0.05。
　　结果：
　　1.成功建立IBD大鼠模型及MSCs治疗组大鼠模型:IBD组无论大体还是显微镜下都显示肠壁出现溃疡,MSCs治疗组肠道病变明显好转,溃疡愈合,但肠壁仍有水肿,少量炎症细胞浸润,荧光显微镜下见GFP标记的MSCs在大肠上皮内定植情况良好,在肠道受损处分布,MSCs定植密度占上皮细胞及隐窝细胞的50%左右,从隐窝基底部到隐窝顶部均见分布。
　　2.基因筛选结果:全基因组表达谱芯片结果显示所测样品数据趋势集中及样品重复性良好,正常大肠组织和MSCs移植后IBD大肠组织差异性表基因共388个,其中上调基因191个,下调基因197个,与33条信号通路相关,主要涉及炎症反应、免疫反应和细胞分化三个方面。
　　3.Atoh1基因在MSCs治疗组的表达量(1.34±0.27)比细胞对照组(0.95±0.81)、正常对照组(0.91±0.15)和IBD组(0.99±0.48)显著升高(P<0.05)。Olfm4基因在MSCs治疗组表达量(1.39±0.54)显著高于细胞对照组(-0.46±0.24)、低于IBD组(2.54±0.20)(P<0.05),而与正常对照组(1.62±0.25)无明显差异(P>0.05)。Plaur基因在MSCs治疗组表达量(0.52±0.13)显著高于正常对照组(0.32±0.03)(P<0.05),而细胞对照组、正常对照组和IBD组之间无统计学差异(P>0.05)。Atoh1、Olfm4及Plaur基因在移植治疗后第14天、21天、28天三个不同时间点的表达量无明显差异(P>0.05)。
　　结论：
　　1.利用全基因组表达谱芯片筛选了MSCs修复炎症性肠组织相关基因。
　　2.Atoh1、Olfm4和Plaur基因是MSCs跨系分化和修复炎症性肠组织的重要调控因子。

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