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【6h】

DNA甲基化在UVA诱导皮肤胚胎成纤维细胞慢性损伤中的作用

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缩略词表

1 绪 论

1.1 问题提出与研究意义

1.2 国内外研究现状

1.3 本文研究的目的和研究内容

1.4 本文的创新点

2 UVA诱导NIH3T3细胞DNMTs的表达

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5 讨论

3 5-az联合UVA辐射处理NIH3T3细胞

3.1 引言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 讨论

4 NIH3T3细胞对UVA辐射的适应性反应

4.1 引言

4.2 实验中用的材料

4.3 相关实验方法及步骤

4.4 实验结果

4.5 讨论

5 结论与展望

5.1 本研究主要结论

5.2 后期研究展望

致谢

参考文献

附录

A. 作者在硕士期间发表的论文目录

B. 作者在硕士期间参加的学术会议

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摘要

背景：
　　皮肤是身体对其环境如紫外线辐射和外源性化学物质等有害因素的屏障。其中长期长波紫外线（UVA）辐射能引起皮肤慢性损伤，造成皮肤光老化，炎症现象以及皮肤癌变。细胞内DN A甲基化在UVA辐射下会发生改变，其中DNA甲基化转移酶（DNMTs）在UVA辐射下的改变会参与细胞的生长、周期、癌变等调节。DNMTs在小鼠胚胎成纤维细胞中受UVA辐射的影响，以及DNMTs的改变与细胞体内的CCND表达的变化的关系是本文的创新点。
　　目的：
　　在不同UVA剂量（25KJ/m2、50KJ/m2、100KJ/m2、150KJ/m2、200KJ/m2）对小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）重复照射（每一次间隔24h）三次下，从蛋白水平和mRNA水平来检测DNMTs的表达；检测不同浓度的5-az（0.25μM,0.5μM,1.0μM）对NIH3T3细胞活力的影响并和与UVA（100KJ/m2）联合作用下对细胞活力的影响以及对细胞的慢性损伤。检测细胞在5-az处理联合UVA诱导辐射作用下，DNMTs（DNMT1, DNMT3a, DNMT3b）表达水平。检测5-az处理联合UVA诱导辐射作用下周期相关基因（CCND1, CCND2）的表达变化。
　　方法：
　　采用MTS法检测UVA和5-az对NIH3T3细胞活力的影响；采用实时定量PCR法(qRT-PCR)来检测DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、CCND1、CCND2、HO-1 mRNA的表达水平变化。采用Western blotting检测DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、CCND1、C C N D2、HO-1等相关蛋白的表达变化。
　　结果：
　　1.多次有规律的UVA辐射下，NIH3T3细胞活力降低，且细胞活力降低的程度与UVA的剂量成剂量依赖性：
　　对NIH3T3细胞进行多次UVA辐射（相同剂量重复三次UVA辐射，每次照射间隔24h）后，不同剂量使细胞的活力呈明显的降低趋势。在低剂量时候，降低的不明显。但在高剂量辐射（100KJ/m2）后与非辐射组相比，细胞的形态，以及细胞的活力皆呈明显的降低趋势。在大剂量辐射下（与对照组相比），在细胞的形态上细胞明显皱缩并存在大量的细胞碎片。
　　2.5-az处理与UVA辐射联合作用对小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast）的细胞各项指标的影响:
　　5-az降低了细胞因UVA辐射诱导的DNMT1，DNMT3a，DNMT3b水平，阻滞了细胞通过调节DNMTs的表达来自我保护。且在联合作用下，细胞内CCND2的表达水平比单个因素作用大，存在叠加效果。
　　3.UVA低剂量预照射下，24小时后高剂量照射，看细胞内对应的DNMTs表达水平变化，以及对氧化应激相关信号通路的影响。
　　与对照组相比较，小剂量UVA预照射组的细胞DNMTs和HO-1的表达同样比未小剂量预处理组表达高。
　　结论：
　　UVA辐射可以对细胞内DNA甲基化起着促进作用，其作用主要是通过对DNMT1，DNMT3a诱导来改变的。DNMTs表达的变化在细胞防御UVA辐射中起到调节作用，在UVA辐射与去甲基化药物的联合作用下，DNMT下降得明显要比单个作用因素强，并且UVA诱导DNMT1变化在去甲基化药物5-az作用下起加强的作用。

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