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基于分子动力学研究表面亲疏水性对纤连蛋白吸附的影响

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1 绪 论

1.1问题的提出及研究意义

1.2 国内外研究现状

1.3 主要研究内容

1.4 本论文的创新点

2 不同亲疏水性表面的制备与表征

2.1 引言

2.2 不同亲疏水性表面的制备与表征

2.3结果与讨论

2.4 本章小结

3 SAMs表面亲疏水性对纤连蛋白吸附的影响

3.1 引言

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

4 纤连蛋白和自组装单分子拓扑文件生成及平衡模拟

4.1 引言

4.2 建模和模拟细节

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

5 纤连蛋白在自组装单分子层表面的吸附机理研究

5.1 引言

5.2 建模和模拟细节

5.3结果与讨论

5.4 本章小结

6 结论及后续工作建议

6.1 结论

6.2 后续工作建议

致谢

参考文献

附录

A. 作者在攻读学位期间参与的科研项目情况

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摘要

植入物植入人体后在其表面首先要发生的事件是蛋白吸附。蛋白在材料表面的吸附直接影响甚至决定植入的成败。大量研究表明，材料表面性质影响蛋白的的吸附量、类型和构象；本课题组最新研究进一步发现，表面化学调控纤连蛋白(Fibronectin, FN)在材料表面的吸附力，并与蛋白构象一起，调控细胞的后期黏附行为，但其机制不明。阐明材料表面化学调控蛋白吸附的机制对于指导材料设计、植入物表面修饰有重要意义。分子动力学模拟（molecular dynamics simulation, MD）可以得到大分子的微观信息，包括原子的位置、速度、原子相互作用力，以及相关的各种能量等。MD与计算机图形显示技术相结合，可使研究者直观地分析蛋白质分子的信息。本课题拟采用MD技术并结合实验研究材料表面亲疏水性对蛋白吸附的影响并试图阐明其影响机制。
　　为实现上述目标，本课题采用金-硫醇自组装技术构建了不同亲疏水性的自组装单分子层表面（Self-assembled Monolayers, SAMs），以纤连蛋白为模型蛋白，实验研究表面亲疏水性对蛋白吸附量、蛋白活性和聚集状态的影响；然后以含有RGD粘附多肽的FNIII10为对象，采用Material Studio(MS)、Visual Molecular Dynamics(VMD)和 NAnoscale Molecular Dynamics(NAMD)对FNIII10吸附进行分子动力学模拟，预测表面亲疏水性对FNIII10吸附位点、聚集方式、RGD柔性、以及结合能等的影响；最后将实验结果与模拟结果进行比较，阐明表面亲疏水性影响FN吸附的分子机制。主要研究工作和结论如下：
　　（1）制备不同亲疏水性SAMs：采用金-烷基硫醇自组装单分子层技术在金表面构建了由不同-OH和-CH3含量构成的不同亲疏水性表面，即 OH-SAMs（100％-OH）、90%-OH-SAMs（-OH:-CH3=90:10）、65%-OH-SAMs（-OH:-CH3=65:35）和CH3-SAMs（100%-CH3），其静态水接触角分别为24.1±2.0o、45.2±2.0o、76.4±2.0o、105.0±2.0o。X射线光电子能谱（X-photoelectron spectroscopy, XPS）表征结果也证明该不同亲疏水性表面的成功构建。
　　（2）表面亲疏水性对纤连蛋白吸附的影响：各SAMs在20μg/mL FN溶液中37 ℃恒温孵育2 h。MicroBCA检测结果表明，随表面疏水性增强，单位面积FN吸附量逐渐增多，满足 OH-SAMs≈90%-OH-SAMs＜65%-OH-SAMs＜CH3-SAMs。ELISA检测结果表明，随表面疏水性增强，FN蛋白层表面RGD的活性逐渐降低，满足OH-SAMs≈90%-OH-SAMs>65%-OH-SAMs>CH3-SAMs。原子力显微镜(Atomic Force Microscope, AFM)观察表明，随表面疏水性增强，FN在各SAMs表面的聚集更紧密；FN在OH-SAMs的聚集最松散，在表面形成了不规则的聚集体，而在CH3-SAMs表面其聚集最为致密。
　　（3）用Materials Studio（MS）构建了不同OH-SAM、CH3-SAM链段的表面的pdb文件，用VMD生成SAMs表面的psf文件和纤连蛋白FN-III10的psf文件，并对材料进行了500 ps的NVT系综下的平衡模拟，对FN-III10进行了1 ns的NVT系综下的平衡模拟。
　　（4）将平衡好的FN-III10与SAMs结合，进行了1 ns的NVT系综下的平衡模拟，获得了能量、RMSD值、吸附位点以及结合能等信息。模拟结果表明：
　　①在亲水性OH-SAMs表面，FN-III10主要依靠氢键与SAMs发生作用，随着表面-OH含量减少，-CH3含量增加，其作用逐渐过渡到疏水作用。
　　②RMSD值表明，随表面疏水性增强，RGD的柔性逐渐降低，相应地，其生物活性也逐渐降低，满足 OH-SAMs>90%-OH-SAMs>65%-OH-SAMs>CH3-SAMs，与ELISA实验结果一致。
　　③蛋白取向分析表明，随表面疏水性增强， FNIII10在表面的取向逐渐由OH-SAMs表面的长轴平行于表面向CH3-SAMs表面的短轴平行于表面偏转，从而排列更加紧密，蛋白吸附量更大，满足 OH-SAMs<90%-OH-SAMs<65%-OH-SAMs　　④表面结合能模拟结果表明，随疏水性增强，表面结合能逐渐增大，满足OH-SAMs<90%-OH-SAMs<65%-OH-SAMs　　（5）综合分析实验结果与模拟结果，可以得出表面亲疏水性调控蛋白吸附的机制是：随着表面疏水性增强，F N蛋白与表面的疏水作用位点增多，表面结合能增大，导致吸附作用增强，从而限制了蛋白骨架的柔性，继而限制了RGD位点的柔性，使得蛋白在细胞黏附过程中不易于调整其构象，以适于细胞黏附和取向；另一方面，表面疏水性增强使FN趋于短轴平行于表面排列，从而使排列更紧密，表面蛋白吸附量更大。

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