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微小残留白血病监测的实验和临床研究--RQ-PCR检测Ig/TCR基因重排在儿童急性淋巴细胞白血病MRD监测中的作用

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摘要

研究背景：急性白血病是儿童时期最常见的恶性肿瘤，其发病率约3/10万，其中急性淋巴细胞白血病（ALL）约占1/3。随着治疗方法的进步，90%以上的ALL患者在诱导后可获得完全缓解（CR），并有70%~80%可获得5年持续完全缓解。然而，仍有20%~30%患者在缓解后复发，这与体内仍存在形态学无法检测的残留白血病细胞，即微小残留白血病（MRD）有关。大量研究证明，MRD是最能反映个体治疗效果和预后情况的信息，也是引起白血病复发的最主要原因之一。在白血病治疗过程中准确测定MRD并分析其意义，对临床追踪病情、判断预后，并据此制定更具针对性的个体化治疗方案等，具有重要意义。Ig/TCR基因含有数量庞大的V、D和J基因片段，这些基因片段在淋巴细胞发育早期发生重排，重排时只有一个V、D或J基因片段随机结合；同时在V-D和D-J的连接区中，可有碱基的缺失、插入突变。因此，Ig/TCR基因重排具有高度多样性，因而具有高度特异性。白血病淋巴细胞的Ig/TCR基因重排均起源于同一恶性克隆，即单克隆性重排，因此，单克隆性Ig/TCR基因重排可作为每种淋巴细胞恶性肿瘤克隆的特异性分子标志。此外，Ig/TCR基因重排在儿童和成人ALL中均具有极高的检出率，欧洲BIOMED-2行动设计的引物系统，使Ig/TCR基因重排在恶性克隆淋巴细胞中的检出率达到100%。由于Ig/TCR基因重排具有上述高特异性和高检出率，使其可作为ALL-MRD检测的特异性标记。实时定量PCR（RQ-PCR）具有高敏感性（达到10-5~10-6）、高特异性、快速、简便、定量等优点。以RQ-PCR检测Ig/TCR基因重排是目前定量追踪MRD的最可靠方法。欧洲研究组织（European Study Group，ESG）已制定出一套ALL-MRD的RQ-PCR检测标准。此标准对RQ-PCR检测Ig/TCR基因重排的定量范围、敏感度、阳性与阴性的界定、Ct值等进行了统一化的规定，有效地控制了假阳性和假阴性，并有利于MRD检测结果在不同实验室之间进行横向比较和评价[3]。目前国内尚缺乏大样本、系统化、标准化，以及以临床结局为观察终点的RQ-PCR监测白血病MRD的研究。因此，建立符合我国国情、适用于区域性或全国性并针对我国ALL患者特有的MRD检测和诊断标准，仍为当前我国ALL研究中的重要课题之一。 目的：以ALL患儿为观察对象，以RQ-PCR为检测方法，以Ig/TCR基因重排为靶目标，评价RQ-PCR检测ALL患儿Ig/TCR在MRD监测中的意义。 方法：⑴标本的选择和处理，选择经骨髓细胞形态学和FCM检查确诊为ALL的病例，一病例分别在以下时间点采集骨髓标本。⑵初诊患者Ig/TCR基因重排的检测 选取Biomed-1行动中的14对引物，PCR扩增初诊标本IgH、Igκ、TCRγ和TCRδ基因重排，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。对PCR阳性产物进行基因扫描，分析Ig/TCR基因重排的克隆性，对基因扫描鉴定为单克隆的PCR产物进行测序。⑶RQ-PCR检测Ig/TCR基因重排方法的建立 根据上述Ig/TCR基因重排的测序结果，设计针对每一例患儿的特异性引物和探针，以albumin为内参基因，建立RQ-PCR检测方法，以特异性Ig/TCR基因重排的相对表达量作为MRD追踪的靶目标。⑷随访患者MRD的追踪 在ALL患者各治疗时点检测Ig/TCR基因重排的相对表达量，观察其在治疗过程中的变化趋势。⑸实验数据分析 根据PCR结果，分析初诊ALL患儿Ig/TCR基因重排的检出率和构成比。根据基因扫描结果，分析不同克隆特性Ig/TCR基因重排的发生率。根据RQ-PCR结果，分析ALL患者MRD水平总体变化规律。比较Ig/TCR基因重排的检出率、克隆特性及相对表达量的变化趋势与各临床特征的关系。实验所得计量资料以±SD表示，计数资料以百分比表示。使用SPSS17.0统计软件对实验数据进行整理和统计分析。以α=0.05为检验水准；以卡方检验比较各临床特征组别与Ig/TCR基因重排发生率、克隆特性的关系；以Kendall检验进行相关性分析；以方差分析比较各组临床特征的MRD变化趋势。 结果：①Ig/TCR基因重排的检出率 在86例初诊ALL患者中，83例（96.51%）可检出一种或一种以上Ig/TCR基因重排，平均每例可检出2.52个Ig/TCR基因重排。②各种Ig/TCR基因重排的检出率 在83例可检出Ig/TCR基因重排的病例中，IgH基因重排的比例最高，达到80.72%（67/83例），其后依次为TCRδ67.47%（56/83例）、Igκ55.42%（46/83例）和TCRγ49.40%（41/83例）。③Ig/TCR基因重排的克隆特性 61例初诊ALL患者共172个Ig/TCR基因重排中，56例（91.80%）可检出单克隆性Ig/TCR基因重排。单克隆性、寡克隆性和多克隆性Ig/TCR基因重排的检出率分别为58.14%、30.81%和11.05%，以单克隆性重排为主，三者之间有显著性差异。在单克隆和寡克隆性基因重排中，四种Ig/TCR基因重排之间无显著性差异；在多克隆性基因重排中，IgH 与TCRγ和TCRδ之间差异有统计学意义。CCR患者和复发患者初诊时Ig/TCR基因重排的检出例数、检出个数以及克隆特性无显著性差异。④RQ-PCR检测Ig/TCR基因重排表达量的结果 ①22例CCR患者初诊时Ig/TCR基因重排的相对表达量为8.85×10-1~2.56×10-2；在诱导治疗结束时，Ig/TCR基因重排相对表达量较初诊时明显下降，已出现MRD阴性病例；在巩固治疗开始前，MRD阴性病例进一步增加，与诱导缓解后的差异有统计学意义；随着治疗时间的延长，Ig/TCR基因重排相对表达量继续下降，在维持治疗前，受检病例均为MRD阴性；②4例复发患儿在诱导缓解治疗至复发前各检测时点MRD均为阳性，从Ig/TCR基因重排的相对表达量开始回升至临床复发的平均时间为3.25个月（2～8个月）。⑤Ig/TCR基因重排与临床特征的关系：在初诊白细胞总数＜50×109、（50~100）×109和＞100×109组中分别为89.80%、53.85%和25.00%，三组之间有显著性差异；在早前B-ALL、前体B-ALL、成熟B-ALL和T-ALL组中的检出率分别为87.18%、93.75%、80.00%和25.00%，T-ALL组与其他三组比较，差异有统计学意义；在L1、L2和L3三组中的检出率分别为83.67%、71.43%和16.67%，三组之间有显著性差异；Ig/TCR基因重排的克隆特性与各临床特征无明显关系；诱导缓解结束时，T-ALL组Ig/TCR基因重排的表达量高于B-ALL组，两组之间有显著性差异；在诱导缓解结束时和巩固治疗前，Ig/TCR基因重排的表达量在强的松7天反应PPR组均高于PGR组，两组差异有统计学意义；在维持治疗前，诱导缓解治疗15天NR组高于Ig/TCR基因重排的表达量高于CR组；初诊骨髓幼稚细胞＜80%组高于≥80%组，组别之间有显著性差异；诱导缓解结束时根据Ig/TCR基因重排表达量重新划分危险组别，与诱导治疗前的危险度分组比较，CCR患者SR、IR、HR病例的比例无显著性差异。但4例复发患儿中，2例在诱导缓解治疗后危险度升级。 结论：⑴Ig/TCR基因重排在ALL患儿中具有较高的检出率；联合多种Ig/TCR基因重排检测的情况下，使用较少的引物，亦可获得较高的检出率。⑵Ig/TCR基因重排在ALL中以单克隆重排为主，可与寡克隆性基因重排同时存在。基因扫描可简便、快捷、准确分析Ig/TCR基因重排的克隆性，有效筛选出不同克隆特性的Ig/TCR基因重排。⑶以RQ-PCR检测Ig/TCR基因重排可反映MRD水平，可作为判断预后、评价疗效、监测复发、指导治疗的有效、可行的重要手段。

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