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两步法细菌内同源重组制备单核细胞趋化蛋白-1重组腺病毒并在胰腺癌细胞中表达

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论文说明：英文缩略语表

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讨论

结论

参考文献

附图

综述 腺病毒载体构建的研究进展

致谢

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摘要

背景及目的胰腺癌(PancreaticCancer)是恶性程度很高的消化道肿瘤。迄今为止，治疗胰腺癌最为有效的方法仍是外科手术切除，但是胰腺癌早期诊断不易，可切除率低。尽管诊疗技术的不断进步，患者的5年生存率仍无明显改善。因此，许多研究致力于胰腺癌高度恶性的分子生物学基础，并尝试通过基因治疗以及以手术为主的综合治疗等途径征服胰腺癌。 单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)是趋化因子超家族CC亚族中对单核细胞趋化活性最强的趋化因子，它由活化的T细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞以及一些肿瘤细胞分泌，具有趋化和激活单核巨噬细胞、记忆性T淋巴细胞以及自然杀伤(NK)细胞的能力。MCP-1已被证实在卵巢癌、膀胱癌等肿瘤中具有抗肿瘤作用。在胰腺癌中，有研究发现患者血中MCP-1水平较正常人高，血中MCP-1浓度的升高是由于胰腺癌组织的分泌，而且，行胰腺癌切除术的患者血中MCP-1水平高的较MCP-1水平低的有更好的预后，提示MCP-1可能是胰腺癌演进中的一个负性调节因子。 基因治疗的关键是实现外源基因的导入，因此，载体的选择是面临的首要问题。腺病毒载体因其宿主范围广、转染效率高、致病性低等优点而成为基因治疗中最常用的载体。构建重组腺病毒载体的方法已有多种，但繁简程度不一。为了使操作更加方便、易行，本项实验采用两步法(Two-stepprotocol)构建MCP-1重组腺病毒，以观察这种方法构建重组腺病毒的可行性及重组效率。并制备出重组腺病毒，为进一步研究MCP-1的功能奠定基础。 方法1.制备含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183pAdEasy-1，然后将前期构建好的MCP-1重组穿梭载体pAdTrack-MCP-1线性化后电穿孔转化BJ5183pAdEasy-1，其在细菌内与pAdEasy-1发生同源重组构建MCP-1重组腺病毒载体pAd-MCP-1； 2.利用脂质体介导基因转染的方法，将PacⅠ酶切线性化的pAd-MCP-1导入到人胚肾上皮细胞HEK293中，包装得到MCP-1重组腺病毒Ad-MCP-1。然后扩增、纯化并测定滴度，PCR法鉴定Ad-MCP-1上是否携带有目的基因序列； 3.复苏胰腺癌SW1990细胞株，将制备好的Ad-MCP-1体外感染SW1990，荧光显微镜观察GFP表达以了解感染情况，RT-PCR法检测感染后MCP-1目的基因表达水平的改变。 结果1.PacⅠ酶切结果得到35kb的腺病毒基因组片段及4.5kb的片段，证实成功构建出pAd-MCP-1。同源重组发生在复制起始位点(ori)及右臂同源区之间。采用两步法，重组成功率可达到30％～50％； 2.脂质体介导将线性化的pAd-MCP-1转染至HEK293细胞3d后开始出现散在的绿色荧光，5d后变得明显，呈典型的“彗星云状”荧光，并观察到HEK293细胞出现肿胀、变圆、漂浮等细胞病变效应(CPE)。PCR法检测到目的基因片段成功重组到腺病毒基因组上； 3.Ad-MCP-1能够有效感染胰腺癌细胞，并表达出MCP-1。Ad-MCP-1感染能明显增强MCP-1的转录活动，其转录水平随病毒感染复数(MOI)的增加而增强。 结论1.两步法能够实现高效的重组腺病毒构建，碱性磷酸酶处理线性化pAdTrack-MCP-1的末端，避免其因自身环化导致不能暴露同源重组位点而不能发生同源重组，而且降低了卡那霉素阳性平板筛选的假阳性率；2.AdEasy系统在穿梭载体上整合了GFP报告基因，使载体的转染及病毒感染变得直观，极大地方便了腺病毒的检测；3.成功制备得到Ad-MCP-1并能有效地感染胰腺癌细胞，Ad-MCP-1的感染效率与病毒感染复数有关；4.Ad-MCP-1的成功制备为进一步研究MCP-1的作用奠定了基础。

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