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家蚕中肠羧酸酯酶基因的克隆及槲皮素和有机磷杀虫剂诱导表达

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1 绪 论

1.1引言

1.2 研究背景

1.2.1 羧酸酯酶的命名与分类

1.2.2 羧酸酯酶的分布和功能

1.2.3 昆虫羧酸酯酶的结构和催化机制

1.2.4 羧酸酯酶底物的特异性

1.2.5 昆虫羧酸酯酶对昆虫的保护作用

1.2.6 家蚕羧酸酯酶的研究现状

1.3 研究目的和意义

1.4主要研究内容与技术路线

1.4.1主要研究内容

1.4.2 技术路线

1.5 创新之处

2实验材料和方法

2.1 实验材料与试剂

2.1.1 材料及试剂

2.1.2 主要实验仪器

2.1.3 主要试剂配制

2.2 实验方法

2.2.1 家蚕中肠特异表达COEs基因的生物信息学分析

2.2.2 总RNA的提取及检测

2.2.3 cDNA的制备和检测

2.2.4家蚕中肠特异表达COEs基因的表达模式分析

2.2.5中肠特异表达COEs基因的克隆和测序

2.2.6槲皮素暴露下中肠特异表达COEs基因的表达分析

2.2.7 杀虫剂暴露后家蚕中肠总 COEs 和 GSTs 酶活测定及克隆所得 4个基因的表达分析

3 结果与分析

3.1 中肠特异表达COEs基因的克隆及表达模式分析

3.2中肠特异表达COEs基因的生物信息学分析

3.3 经有机磷杀虫剂暴露后家蚕中肠COEs和GST活性的变化

3.3.1 经有机磷杀虫剂暴露后家蚕的存活状况

3.3.2 蛋白浓度标准曲线

3.3.3 有机磷杀虫剂对家蚕COEs活性的影响

3.3.4 有机磷杀虫剂对家蚕GST活性的影响

3.4经有机磷杀虫剂暴露后中肠特异表达COEs基因的变化

3.5经槲皮素暴露后中肠特异表达COEs基因的变化

4讨 论

5 结论与展望

致谢

参考文献

附录

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摘要

羧酸酯酶是一种广泛分布于动物、植物和细菌等生物的多功能酶系。由于序列的差异和底物的不同,COEs可分为八类:gliotactin,α-酯酶,乙酰胆碱酯酶,β-酯酶,神经趋化蛋白,glutactin,保幼激素酯酶和神经连接蛋白。研究表明,COEs在昆虫对杀虫剂的抗性和降解毒物的过程中起到关键作用。中肠做为昆虫代谢外源有毒物质的主要场所,其内有大量的解毒酶表达。研究发现家蚕中肠特异表达的COEs能被有机磷杀虫剂显著诱导,暗示它们在外源有毒物质的代谢中发挥重要作用。本文以家蚕大造品系为材料,选取家蚕幼虫中肠内特异表达的α-家族羧酸酯酶基因Bmae2、Bmae17、Bmae18和Bmae27进行了克隆和序列分析,同时研究了桑叶次生代谢物质槲皮素和3种常用的有机磷杀虫剂(辛硫磷,毒死蜱和敌敌畏)对这4个基因表达的影响。另外,还测定了,OPs暴露后,家蚕中肠COE酶活性的变化。主要结果如下:
  1.经cDNA克隆,获得家蚕羧酸酯酶Bmae2、Bmae17、Bmae18和Bmae27基因的完整编码区序列长度分别为1626bp、1629bp、1596bp和1680bp。
  2.利用Signal IP4.0在线预测发现Bmae2、Bmae17、Bmae18和Bmae27分别含有一个20、20、17和14个氨基酸的信号肽,暗示它们可能为分泌蛋白。与其它昆虫相关的多条COEs序列比较结果显示,Bmae2和Bmae17保留羧酸酯酶活性必须的催化残基 Ser、Glu和 His,也保持着α/β-酯酶家族的特征基序Gly-x-Ser-x-Gly。但Bmae18和Bmae27的Ser残基分别突变为Asp和Gly残基。因此,推测Bmae2和Bmae17可能仍保持着酯酶的水解活性。
  3.表达谱检测表明:Bmae2、Bmae17、Bmae18和 Bmae27均在家蚕中肠特异表达,暗示这4个基因可能在家蚕中肠对外源有毒物质的代谢过程中起重要作用。
  4.有机磷杀虫剂暴露后家蚕中肠羧酸酯酶活性变化:用3种杀虫剂诱导处理的家蚕5龄第2天幼虫,其中肠COEs活性有显著地提高,毒死蜱、辛硫磷、敌敌畏的低/高浓度处理组诱导的最高酶活性分别是对照组的1.63/1.16、1.92/1.33、2.48/1.68倍。
  5.槲皮素暴露下中肠特异表达羧酸酯酶基因表达的变化:Bmae2、Bmae17、Bmae18和Bmae27均能被槲皮素诱导,最大诱导倍数分别为6.90、2.21、1.30和8.78倍。
  6.经OPs处理家蚕后对克隆所得4个COEs基因表达量的变化:经半定量PCR和荧光定量PCR检测,Bmae17和Bmae27在低浓度辛硫磷处理3天内均上调表达,与酶活检测结果基本一致,推测这2个基因可能主要参与对辛硫磷的解毒作用:敌敌畏处理组家蚕只有在处理第3天时中肠内的Bmae17、Bmae18和Bmae27的表达量显著上调,在处理的前两天呈现出被抑制或与对照无显著差异的现象,毒死蜱处理组也出现类似现象,与酶活检测结果不完全一致,推测中肠表达的其它COEs可能参与了这2种农药的解毒。
  以上结果显示,克隆所得的4个基因均能够被有机磷杀虫剂和槲皮素诱导,中肠内总的COEs酶活性经有机磷杀虫剂诱导后也有显著提高,推测家蚕中肠特异表达的羧酸酯酶在家蚕对外源有毒物质的降解过程中起重要作用。

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