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模拟病理状态下气道上皮组织对气道平滑肌增生的影响研究

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哮喘(Asthma)作为一种慢性呼吸道疾病，正日益成为严重威胁人类健康的重大问题。令人遗憾的是，科学界对哮喘病的病因和发展过程至今还没有完全认识清楚，其病理机制也一直是医学上的重要难题。
　　 气道是气体进出肺的通道。有哮喘的人呼吸道发炎，这使得呼吸道变肿胀也非常敏感。他们往往对某些吸入物质反应强烈。当气道反应，周围的肌肉收紧时，气道缩小，造成流入肺部的气体不足。甚至肿胀也可以恶化，使气道更窄。
　　 气道平滑肌的增生则是哮喘的主要发病症状之一，有报道证明在哮喘个体的肌细胞的增生速度远高于非哮喘个体。虽然皮质类固醇通过减少细胞周期蛋白D1的表达以及视网膜母细胞瘤蛋白磷酸化，能抑制正常气道中肌细胞的增生，但是在哮喘个体中却没有效果。尽管做了如此多的研究，但是关于气道平滑肌增生还有很多问题额待解决。
　　 气道上皮组织在呼吸道系统的防御中起着至关重要的作用，气道上皮组织通过其拦截系统阻止组织外源有害刺激对气道上皮的损害，从而保护呼吸道，上皮脱落，特别是在痰中有成团的上皮细胞以及支气管中的上皮脱落是上皮受损的明显现象，在接下来的上皮修复过程中，气道上皮会分泌促进细胞生长、迁移的信号因子，这些因子中很多都能刺激起气道平滑肌的增生。
　　 气道中无论是气道平滑肌还是气道上皮在哮喘发生时都有显著的病理特征，但是两者之间存在怎样的信号交流，目前还没有完整的理论和解释。目前研究人员做了大量关于气道平滑肌的研究，但是关于气道上皮组织对气道平滑肌增生的影响尚未有报道。本课题组在体外用多聚左旋精氨酸(poly-L，arginine，PLA)构建上皮细胞(AEC)损伤模型，并与正常平滑肌细胞(ASMC)共培养(我们在哮喘发病过程中，嗜酸性粒细胞是主要的效应细胞，嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)是其主要效应成分。PLA作为ECP的类似物，可以在体外模拟细胞受损伤的状态)。而为了更真实地模拟哮喘发生时气道上皮组织的状况，本课题还在共培养过程中对AEC施加外部压力。最后检测共培养系统中ASMC增殖情况，以此对气道上皮组织对气道平滑肌增生的影响作一个初步探索：
　　 ①为了构建体外模型：本课题在体外收集并培养AEC和ASMC，并用形态学和免疫荧光学方法对收集到的细胞进行鉴定。鉴定结果表明，用组织块贴壁法获得了大量的原代ASMC，用胰蛋白酶冷消化法获得了大量的AEC。
　　 ②PLA对大鼠气道上皮细胞活性影响研究：设置不同0-50μM(每5μM浓度差为一个间隔梯度)共10个浓度梯度的PLA对AEC进行处理，处理时间为24h。然后用台盼蓝进行细胞计数。最后结果显示，与对照组比较，即使小浓度的PLA(5μM)也对气道上皮细胞有明显的毒性作用(P<0.01).而在PLA浓度大于20μM时，毒性作用的变化不再明显(PLA浓度>20μM时各组分之间的P>0.01)。
　　 ③AEC损伤模型构建：对AEC进行高浓度(50μM)PLA短时间处理(10分钟)，构建气道上皮细胞损伤模型。
　　 ④共培养装置的设计：为了在共培养时能对气道上皮细胞进行单独施压，我们改进了共培养的压力提供装置。最后，我们在设计的装置能提供我们需要的稳定压力(14KPa)。
　　 ⑤本实验设置5个实验组：ASMC单独培养为对照组(A)、ASMC与AEC共培养(B)、ASMC与受损伤的AEC共培养(C)、ASMC与未受损伤的AEC共培养并施加外部压力(D)、ASMC与受损伤的AEC共培养并施加外部压力(E)
　　 ⑥共培养条件下ASMC增值检测：每12h用MTT测量一次ASMC的生长OD值，共取5个时间点，既12h、24h、36h、48h、60h分别测量一次每组细胞的OD值，用软件进行相关的分析结果显示：60h时，BCDE组与A组以及BCDE组之间p均<0.01.E组的OD最大，E组中ASMC的生长速度明显高于其他组。而E组与D组以及E组与C组比较都有显著性差异(p<0.01)，说明了外部压力和AEC损伤对ASMC的增值有独立的作用。
　　 我们最后得出结论，在体外研究中，气道上皮在损伤和接受外部刺激后，加剧了气道平滑肌的增生。

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