AAV8载体介导ACE2基因转导在实验性自身免疫性葡萄膜炎中作用及机制的研究

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背景:葡萄膜炎是一种由自身免疫或感染等原因引起的严重威胁患者视力的炎症性眼病。它是导致全球范围内青壮年视力损害，甚至致盲的主要原因之一。实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）是一种经典的模拟人自身免疫性葡萄膜炎的动物模型。它是一种临床表现和特点与多种葡萄膜疾病非常相似的T细胞介导的疾病模型，比如Beh?ets病(BD)和Vogt-Koyanagi-Harada(VKH)综合征。目前研究较为透彻的是，有两种辅助性T（Th）细胞亚型：Th1和Th17细胞在葡萄膜炎的发病机制中发挥着至关重要的作用。
　　肾素血管紧张素系统（RAS）是调节心血管以及肾脏系统生理功能的重要激素系统。RAS系统的功能紊乱还可以导致多种炎症以及自身免疫性疾病。近年来新发现了一条主要由血管紧张素转换酶2(ACE2)、血管紧张素Ang-(1-7)及其受体Mas组成的RAS系统保护性轴。ACE2/Ang-(1–7)/Mas轴不仅可以抵消经典的损伤性轴 ACE/Ang II/AT1R带来的损害性效应，还可以直接发挥一系列如抗纤维化、抗炎症等保护性效应。前期研究表明，增加 ACE2的表达，从而活化ACE2/Ang-(1–7)/Mas轴可在糖尿病视网膜病变以及LPS诱导的炎症性眼病中发挥抗炎作用。然而，过表达ACE2在自身免疫性炎性眼病中的保护作用及其具体分子机制尚不清楚。
　　基于前述研究背景，本课题主要针对以下几个方面内容进行了研究：(1) AAV8介导的ACE2基因转导是否可以在EAU中发挥保护作用？(2)过表达 ACE2是否能调节EAU小鼠眼部的免疫反应？(3)过表达ACE2在EAU中发挥的保护作用是否由ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴介导？(4)过表达ACE2在EAU中发挥保护作用的可能分子机制。通过对这几部分内容的探索，期望能找到葡萄膜炎新的治疗靶点。
　　目的：活化ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴在多种炎症性及自身免疫性疾病中有重要的保护作用。因此，本研究的目的是探讨AAV8介导的ACE2基因过表达在EAU小鼠中的保护作用，以及过表达ACE2在EAU病理过程中发挥抗炎作用的可能分子机制。
　　方法：B10.RIII小鼠行视网膜下腔注射 AAV8-ACE2或其对照载体AAV8-eGFP，3周后小鼠皮下注射光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP161-180)肽段诱导EAU模型。在诱导EAU模型后不同时间点对小鼠眼前房炎症进行裂隙灯下观察及拍照，并同时进行临床评分。并在炎症高峰期（第14天），取小鼠眼球进行石蜡切片，行HE染色及进行组织病理学评分。诱导EAU后第14天，采用视网膜电图（ERG）检测小鼠视网膜功能的变化。利用real-time PCR对视网膜炎症因子以及M1/M2型巨噬细胞表面标记物的表达进行检测。在EAU小鼠的脾脏淋巴细胞中，采用相应通路的抑制剂对可能参与EAU病理过程的信号通路进行酶联免疫吸附试验（ELISA）检测。进一步，对筛选出的信号通路在小鼠视网膜样本中行Western Blotting验证。
　　结果：AAV8-ACE2+EAU组小鼠眼前房炎症及临床评分均明显低于AAV8-eGFP+EAU组及 EAU组小鼠。组织病理学HE染色显示AAV8-ACE2处理的EAU小鼠视网膜褶皱以及炎症细胞的渗出均较AAV8-eGFP处理的EAU小鼠显著减少。AAV8-ACE2+EAU组小鼠在ERG检测的明适应以及暗适应中，其a波、b波的振幅均较AAV8-eGFP+EAU组及 EAU组小鼠明显恢复。AAV8-ACE2处理的EAU小鼠视网膜促炎因子的mRNA表达较AAV8-eGFP处理组明显降低,而抑炎因子明显增高。AAV8-ACE2转导抑制EAU小鼠眼部Th1/Th17反应，并促进M1型巨噬细胞向M2型转化。ELISA及Western Blotting结果提示MAPK,NF-κB及STAT3通路均参与ACE2过表达在EAU中的保护作用。ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴的抑制剂A-779可以抵消ACE2过表达发挥的抗炎效应，提示过表达ACE2在EAU小鼠中发挥的抗炎作用主要由ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴介导。
　　结论：AAV8介导的ACE2过表达可通过活化 RAS系统保护性轴：ACE2/Ang-(1-7)/Mas从而在EAU小鼠眼部炎症中发挥保护作用。这条保护性轴可以调节眼部Th1/Th17反应以及M1/M2型巨噬细胞的极化。我们的研究结果提示活化ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴在调控眼部免疫反应中发挥重要作用。增强ACE2表达可能为葡萄膜炎提供新的治疗策略。

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作者
邱一果;
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作者单位

重庆医科大学;

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授予单位重庆医科大学;
学科眼科学
授予学位博士
导师姓名杨培增;
年度 2017
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类其他葡萄膜疾病;血清疗法、免疫疗法;
关键词
免疫性葡萄膜炎; 血管紧张素转换酶2; 自身免疫; 基因治疗; 抗炎作用;

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