基于恒温扩增和DNA纳米技术对生物活性物质检测的新方法研究

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生物传感器是由生物活性材料（如多肽、核酸、抗体、细胞、组织等）、换能器以及信号处理装置构成的分析装置或器件。近年来，随着分子生物学、材料科学、生物分析化学、临床检验诊断学等不断发展，恒温扩增和DNA纳米技术的介入为生物传感器的发展提供了新的活力。能够对多种生物活性物质（细胞、细菌、核酸、无机离子、多肽、小分子物质等）进行快速、灵敏、特异、准确的检测。本研究主要基于恒温扩增和DNA纳米技术对可卡因和miRNA检测方法进行研究，所建立的方法能够准确、快速、超灵敏检测可卡因和miRNA，为临床疾病诊断、法医毒物分析和环境监测等提供有力的工具。研究内容分为以下两部分：
　　1.基于超分子适体和滚环扩增的电化学传感器对可卡因高灵敏检测
　　可卡因是当今世界主要的成瘾性药物之一,并且对中枢神经系统有很强刺激作用，对可卡因进行定性定量分析在法医毒物分析、药理学、代谢组学中具有重要意义。因此，急需发展简便、快速、超灵敏的可卡因检测新方法。本研究整合超分子适体、滚环扩增及生物素和链酶亲和素信号放大策略，以电化学生物传感器为平台，建立一种可卡因检测新技术新方法。可卡因适体被拆分成两个片段，在靶物质可卡因存在的条件下，固定在电极表面适体片段和另外一个生物素标记的适体片段结合，形成超分子适体，接着加入链酶亲和素和生物素标记环化DNA。在phi29 DNA聚合酶和dNTPs存在下启动滚环扩增，从而产生大量串联重复序列。然后链霉亲和素标记的碱性磷酸酶与电极上剩余的生物素标记的检测探针结合，引起酶联信号放大，此信号随着可卡因浓度的增加而增大。双重信号放大策略极大提高适体传感器灵敏度。在最优的条件下，电化学信号与可卡因的浓度在2 nM-500 nM的浓度范围内呈现良好线性关系，最低检测限为1.3 nM（信噪比为3）。此外，所建立的生物传感方法能够对尿液样本中的可卡因进行直接检测，其结果与传统的GC-M S相符合。
　　2.基于链置换扩增和DNA纳米技术对microRNA超灵敏检测
　　MiRNA是一类内源性非编码的小分子 RNA，其异常表达与相关肿瘤的早期诊断、疗效检测及预后判断等密切相关。因此，发展灵敏、特异、简便、快速的miRNA检测新方法具有十分重要的意义。本研究整合链置换扩增反应和具有DNA酶的催化茎环自组装技术，建立通用型比色生物传感器用于miRNA超灵敏检测。在靶物质miRNAs存在的条件下，诱发链置换扩增反应，从而释放DNA片段，均相扩增DNA产物启动CHA，接着生成大量CHA产物。同时CHA产物与hemin结合形成G-四联体-hemin DNA酶，其具有辣根过氧化物酶活性，从而催化一个比色反应。在最优的实验条件下，在5 fM-5 n M的浓度范围内吸光度与miRNA浓度的对数成线性关系，最低检测限为1.7 fM（信噪比为3）。所建立的简单和高效信号放大机器为不同miRNAs的检测提供一个通用的平台。因此，为未来临床诊断中 miRNAs的检测提供一种潜在的新技术新方法。

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作者
申波;
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作者单位

重庆医科大学;

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授予单位重庆医科大学;
学科临床检验诊断学
授予学位硕士
导师姓名丁世家;
年度 2015
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类实验室诊断;
关键词
生物传感器; 恒温扩增; DNA纳米技术; 活性物质检测;

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