孕期酒精暴露致胎鼠心脏发育基因表达异常的组蛋白乙酰化调控机制

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第一部分:孕期酒精暴露对胎鼠心脏发育相关核心转录因子组蛋白乙酰化修饰的影响
　　目的:
　　探讨孕期酒精暴露对HATs和HDACs活性及心脏核心转录因子GATA4、MEF2C、NKX2.5、TBX5的组蛋白乙酰化修饰状态的影响。
　　方法:
　　受孕ED8.5的昆明小鼠随机分为空白对照组和酒精组，酒精组于ED8.5给予56％酒精（5mg/kg·d）连续灌胃1周，空白对照组给予等量生理盐水灌胃，收集ED14.5和ED16.5胎鼠心脏及PND0.5和PND7新生鼠心脏进行如下检测：
　　（1）比色法检测HATs和HDACs的活性；
　　（2）Western blot检测心脏组织中组蛋白H3AcK9及ac-H3的乙酰化水平；
　　（3）ChIP-Q-PCR检测心脏核心转录因子GATA4、MEF2C、NKX2.5、TBX5启动子区域组蛋白ac-H3、H3AcK9乙酰化水平；
　　（4）运用顶空气相色谱法检测孕鼠血液酒精浓度，并观察酒精相关副作用。
　　结果:
　　（1）以5mg/kg剂量酒精灌胃孕鼠40分钟后，其血液酒精浓度达到147.5mg/100ml，且该剂量酒精所导致的流产、死胎及肠胀气的发生率约为15%。随着酒精剂量的增加其血液酒精浓度及相关副作用的发生率也逐渐增加。
　　（2）比色法结果显示在胎鼠心脏发育的ED14.5、ED16.5、PND0.5酒精可以提高胎鼠及新生鼠心肌组织中HATs活性，与空白对照组相比差异显著（P<0.05），而对心肌组织中HDACs活性无明显影响，与空白对照组相比无统计学意义（P>0.05）。
　　（3）Western blot结果显示孕期酒精暴露可以显著提高胎鼠及新生鼠心肌组织中组蛋白ac-H3及H3AcK9乙酰化水平（P<0.05）。
　　（4）ChIP-Q-PCR结果显示孕期酒精暴露可以显著提高胎鼠和新生鼠心脏核心转录因子GATA4、MEF2C、NKX2.5、TBX5启动子区域组蛋白ac-H3和H3AcK9乙酰化水平（P<0.05）。
　　结论:
　　（1）孕期酒精暴露可以选择性地提高胎鼠及新生鼠心肌组织中HATs活性，而对HDACs活性无显著影响。
　　（2）孕期酒精暴露可以显著提高心肌组织中组蛋白ac-H3和H3AcK9乙酰化水平。
　　（3）孕期酒精暴露可导致心脏核心转录因子GATA4、MEF2C、NKX2.5、TBX5启动子区域组蛋白ac-H3和H3AcK9高乙酰化状态。
　　第二部分:组蛋白乙酰化酶对心脏发育相关转录因子的组蛋白乙酰化调控作用
　　目的:探讨HATs对心脏核心转录因子GATA4、NKX2.5、MEF2C和TBX5启动子区域组蛋白乙酰化调控作用。同时揭示酒精暴露所致的组蛋白高乙酰化对心脏核心转录因子GATA4、NKX2.5、MEF2C和TBX5转录活性的影响。
　　方法:
　　（1）选取正常ED14.5胎鼠为研究对象，针对心脏核心转录因子GATA4、NKX2.5、MEF2C和TBX5启动子区域前1000bp设计特异性引物，分别以ChIP级抗p300、CBP、PCAF、SRC1、GCN5抗体做ChIP-PCR检测HATs各个亚型对上述心脏核心转录因子的调控作用。
　　（2）收集ED14.5、ED16.5胎鼠心脏及PND0.5、PND7新生鼠心脏；实验设立空白对照组和酒精暴露组，针对心脏核心转录因子GATA4、NKX2.5、MEF2C和TBX5启动子区域前1000bp设计特异性引物，分别以ChIP级抗p300、CBP、PCAF、SRC1、GCN5抗体行ChIP-Q-PCR检测酒精对上述心脏核心转录因子启动子区域HATs各个亚型结合量的影响。
　　（3）收集ED14.5、ED16.5胎鼠心脏及PND0.5、PND7新生鼠心脏；实验设立空白对照组和酒精暴露组，针对心脏核心转录因子GATA4、NKX2.5、MEF2C和TBX5 CDS核心编码区设计特异性引物，运用实时定量RT-PCR检测上述心脏核心转录因子mRNA表达水平。
　　结果:
　　（1）ChIP-PCR结果显示HATs亚型p300、CBP、PCAF、SRC1及GCN5均能结合到心脏核心转录因子GATA4、MEF2C、NKX2.5及TBX5启动子区域。
　　（2）酒精暴露组HATs亚型p300、CBP、PCAF、SRC1在心脏核心转录因子GATA4、MEF2C、NKX2.5及TBX5启动子区域的结合量显著增高，与空白对照组比较有统计学意义（P<0.05），而HATs亚型GCN5在上述转录因子启动子区域的结合量酒精组与空白对照组比较无显著差异（P>0.05）。
　　（3）胎鼠心脏核心转录因子GATA4、MEF2C、NKX2.5及TBX5的mRNA表达水平在酒精暴露组高于空白对照组，且在ED14.5、ED16.5胎鼠心肌组织中GATA4 mRNA及MEF2C mRNA表达水平酒精组与空白对照组相比差异显著（P<0.05）；NKX2.5 mRNA表达量在ED14.5、ED16.5及PND0.5酒精组与空白对照组相比差异显著（P<0.05）；TBX5 mRNA表达量在ED14.5酒精组显著高于空白对照组（P<0.05）。
　　结论:
　　（1）生理状态下HATs亚型p300、CBP、PCAF、SRC1及GCN5均可以结合到心脏核心转录因子GATA4、MEF2C、NKX2.5及TBX5启动子区域，参与上述转录因子组蛋白乙酰化修饰调控。
　　（2）孕期酒精暴露可以显著提高HATs亚型p300、CBP、PCAF、SRC1在心脏核心转录因子GATA4、MEF2C、NKX2.5及TBX5启动子区域的结合量。
　　（3）孕期酒精暴露可以显著提高胎鼠心脏核心转录因子GATA4、MEF2C、NKX2.5及TBX5的转录活性。
　　第三部分:漆树酸抑制组蛋白乙酰化下调酒精诱导的心脏发育相关基因的过表达
　　目的:探讨HATs抑制剂漆树酸通过抑制组蛋白乙酰化修饰状态从而下调酒精诱导的心脏核心转录因子GATA4、TBX5及心脏发育相关基因α-MHC、Cx43、cTnT、α-actin过表达的作用。
　　方法:
　　选取昆明小鼠为研究对象，将ED8.5的孕鼠随机分为空白对照组、空白对照+DMSO组、酒精组、酒精+DMSO组，酒精+DMSO+漆树酸组、空白对照+DMSO+漆树酸组。酒精组给予56%酒精（5mg/kg·d）连续灌胃1周，空白对照组给予等量生理盐水灌胃，空白对照+ DMSO组给予等量生理盐水灌胃的基础上再给予等量DMSO腹腔注射，酒精+DMSO+漆树酸组给予酒精（5mg/kg·d）灌胃，同时给予DMSO溶解的漆树酸腹腔注射（5mg/kg·d）；在ED14.5收集胎鼠心脏进行以下检测：
　　（1）分别以抗HATs亚型p300、PCAF、SRC1抗体及抗H3AcK9抗体行染色质免疫共沉淀，针对心脏核心转录因子GATA4、TBX5启动子区域设计特异性引物，运用Real-Time PCR扩增抗p300、PCAF、SRC1及H3AcK9抗体募集到的DNA片段，检测p300、PCAF、SRC1在上述心脏核心转录因子启动子区域的结合量及组蛋白H3AcK9乙酰化水平。
　　（2）实时定量RT-PCR检测心脏核心转录因子GATA4、TBX5及心脏发育相关基因α-MHC、Cx43、cTnT、α-actin的 mRNA表达水平。
　　（3）Western blot检测组蛋白H3AcK9乙酰化水平及心脏发育相关基因α-MHC、Cx43、cTnT、α-actin的蛋白表达水平。
　　结果:
　　（1）Western blot结果显示酒精暴露组胎鼠心肌组织组蛋白H3AcK9乙酰化水平显著高于空白对照组（P<0.05），ChIP-Q-PCR结果表明心脏核心转录因子GATA4、TBX5启动子区域组蛋白H3AcK9乙酰化水平在酒精暴露组显著高于空白对照组（P<0.05），而漆树酸能够显著抑制酒精所致的组蛋白高乙酰化（P<0.05）。
　　（2）ChIP-Q-PCR结果表明心脏核心转录因子GATA4、TBX5启动子区域p300、PCAF、SRC1的结合量在酒精暴露组显著高于空白对照组（P<0.05），漆树酸能够显著降低p300和PCAF在心脏核心转录因子GATA4、TBX5启动子区域的结合量（P<0.05）；但漆树酸并不能降低SRC1在心脏核心转录因子GATA4、TBX5启动子区域的结合量（P>0.05）。
　　（3）实时定量RT-PCR结果显示酒精暴露可以显著提高心脏核心转录因子GATA4、TBX5及心脏发育相关基因α-MHC、Cx43、cTnT mRNA表达水平（P<0.05），但酒精暴露并不能提高α-actin的mRNA表达水平（P>0.05）；漆树酸能够显著下调酒精暴露所致的GATA4、TBX5、α-MHC、Cx43、cTnT的mRNA过表达（P<0.05）。
　　（4）Western blot结果显示孕期酒精暴露可以显著提高胎鼠心脏发育相关基因α-MHC、Cx43、cTnT蛋白表达水平（P<0.05），但酒精暴露并不能提高α-actin的蛋白表达水平（P>0.05）。而漆树酸能够显著下调酒精暴露所致的α-MHC、Cx43、cTnT的蛋白过表达（P<0.05）。
　　结论:
　　（1）漆树酸可以通过抑制p300、PCAF在心脏核心转录因子GATA4、TBX5启动子区域的结合量，从而降低GATA4、TBX5启动子区域组蛋白H3AcK9乙酰化水平，进而下调GATA4、TBX5的转录活性。
　　（2）漆树酸能够在转录和蛋白水平抑制酒精暴露诱导的心脏发育相关基因α-MHC、Cx43、cTnT的过表达，但对α-actin的表达水平无显著影响。

著录项

作者
彭昌;
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作者单位

重庆医科大学;

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授予单位重庆医科大学;
学科儿科学(心血管内科)
授予学位博士
导师姓名田杰;
年度 2015
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类生活制度与卫生;
关键词
孕期酒精暴露; 组蛋白乙酰化酶; 转录因子; 胎儿心脏发育; 基因调控;

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