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【6h】

基于对蛋白质色氨酸残基荧光猝灭的均相亲和分析方法及其应用

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摘要

前言

第一部分 8-苯胺-1-萘磺酸测定人血清白蛋白含量

1 实验材料

2 ANS测定ALB实验方法的建立

3 结果

4 本部分小结

第二部分 荧光滴定法测定单抗位点浓度

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 数据处理

5 本部分小结

第三部分 低亲和力链亲和素荧光探针的设计合成与应用

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 本部分小结

全文总结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果及发表的论文目录

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摘要

以蛋白质中色氨酸或酪氨酸残基为荧光共振能量转移供体,荧光探针作为FRET接受体可进行均相亲和分析;FRET探针需包含作为蛋白色氨酸接受体的荧光团和蛋白特异性配体两部分;形成复合物后激发色氨酸测定FRET效应可确定复合物的量，从而建立对应的均相亲和分析系统。理论上，此法可竞争结合测定非荧光配体、非竞争结合测定对应蛋白、滴定分析标定对应蛋白含量、竞争结合测定非荧光配体亲和力等。这些应用的关键是获得所需FRET探针。
　　本文第一部分建立了一种均相测定白蛋白(ALB)含量的荧光新方法。该法利用荧光探针8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)与白蛋白在特定条件下的高亲和力结合，在280 nm和350 nm波长激发下同时测定形成的复合物在470 nm的荧光发射信号来测定血清中白蛋白的含量。ANS是白蛋白的非特异性荧光配体，亲和力中等;在结合的ANS和白蛋白色氨酸残基之间的FRET现象早已报道。ANS与ALB复合物有适度的量子产率，但ANS在缓冲水溶液中的信号可忽略，故游离ANS在280nm处激发不会造成高本底，可测定白蛋白和ANS复合物的荧光。ANS与白蛋白的结合涉及疏水和静电相互作用，用低离子强度缓冲液和稍低pH值可提高ANS与白蛋白亲和力。用Matlab拟合ANS滴定ALB和ALB滴定ANS曲线得到解离常数(Kd)接近0.15μM。此外，280nm激发下复合物中FRET效应进一步提高ANS作为生物传感器测定白蛋白灵敏度和选择性。通过对50例白蛋白浓度15～55 g/L临床血清标本测定，变异系数为5％以下。同时新方法对于常见的球蛋白，对潜在的干扰物青霉素和肝素，以及其他常见的干扰物质有更好的抗干扰能力。同时结果显示在280或350纳米激发，与溴甲酚绿法(BCG)呈良好的相关性，且Bland-Altman分析证明了两种的一致性;与免疫比浊法测定结果相关性很高，且Bland-Altman分析证明二者一致。特殊的是，280 nm激发产生FRET效应对应的方法抗干扰能力、与免疫比浊法测定结果的一致性还高于BCG法。可见，利用与蛋白结合产物的量子产率增加效应及复合物内部的FRET效应设计检测特定蛋白的荧光探针，其测定的特异性和灵敏度更好。
　　本文第二部分建立了一种基于对单抗的色氨酸荧光淬灭作用，从头校准单克隆抗体含量的新方法。单克隆抗体（单抗）是生物分析必不可少的生物材料。在实际应用中，单克隆抗体的含量应准确校准跟踪。六组氨酸(6His)被广泛用于蛋白质和融合表达及其单克隆抗体(单抗-6His)是用于检测的6His-标签的目的蛋白。单抗-6His中使用的6His滴定曲线作为非荧光探针可以记录在340nm处荧光。另一方面，丹磺酰胺是色氨酸残基的受体，而丹磺酰的6His(DNS-6His)作为FRET探针记录滴定曲线在540 nm荧光发射或340hm荧光猝灭，单抗-6His中的滴定曲线的拟合记录为荧光在340 nm处具有任一探针遇到不收敛为单抗-6His中的量化。这两种类型的单克隆抗体的探头可以有足够的纯度进行跟踪。根据单克隆抗体激发波长为280 nm的两种类型的探针的滴定曲线，可以在340 nm处记录荧光，且通过荧光共振能量转移的探针也可记录探针的荧光，滴定曲线的分析可以校正结合位点单抗含量，从而证明这种方法是有效和普遍适用的。
　　本文第三部分设计合成低亲和力链亲和素荧光探针基于FRET和竞争结合测定生物素。链霉亲和素（Streptavidin，SA）与生物素的解离常数为10-15M，亲和力是抗原抗体反应（10-5～10-11M）的1万倍以上。设计并合成了四种低亲和力链亲和素荧光探针，通过聚乙二醇单甲醚(mPEG)或季胺碱阳性离子的修饰来降低生物素(D-biotain)与SA的亲和力，得到解离常数约为11nM的探针，通过探针与Bio竞争结合SA，利用FRET效应检测探针与SA复合物，初步测定Bio标准曲线。此种方法获得很好的线性响应，有一定应用价值。

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