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【6h】

GW112 Mrna3'端非翻译区特异性结合蛋白研究

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声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

1 基因GW112的研究概况

1.1 GW112基因简介

1.2 GW112基因在胃癌中的研究进展

2 3’非翻译区研究概况

3 RNA结合蛋白研究概况

4 核仁素蛋白

4.1 核仁素蛋白简介

4.2 核仁素蛋白与本研究的关系

第一部分 GW112mRNA3’端非翻译区制备与纯化

1 实验材料

1.1 细胞系、甘油菌

1.2 主要试剂

1.3 主要实验仪器

1.4 试剂配制

2 实验方法

2.1 转录模板的获得

2.2 PCR扩增目的片段

2.3 细胞体外转录GW112 3’不翻译区DNA成RNA探针

2.4 RNA探针的纯化

2.5 RNA探针的检测

3 实验结果

3.1 GW112mRNA3’不翻译区PCR扩增鉴定

3.2 RNA探针检测结果

4 讨论

第二部分 GW112mRNA3’不翻译区特异性结合蛋白的体外筛选及鉴定

1 实验材料

1.1 细胞株

1.2 主要试剂

1.3 主要实验仪器

1.4 主要试剂配制

2 实验方法

2.1 细胞培养和收集

2.2 细胞总蛋白提取

2.3 体外反应纯化特异性结合蛋白

2.4 蛋白质质谱鉴定

2.5 Western Blot检测核仁素蛋白

3 实验结果

3.1 蛋白胶条银染结果

3.2 核仁素蛋白的质谱鉴定结果

3.3 Western Blot验证质谱结果

4 讨论

参考文献

全文总结

附图

文献综述 真核生物mRNA 3’端非翻译区与肿瘤的关系

致谢

攻读硕士学位期间发表沦文情况

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摘要

目的: 人olfactomedin4(OLFM4)基因又称抗凋亡分子GW112,在胃癌中特异性高表达,并且在胃癌细胞的增殖和调控中起着非常重要的作用。真核生物mRNA大多数的调控元件都位于非翻译序列中,这些调控元件能够通过与特定RNA结合蛋白作用来进行基因表达调控。所以本次研究目的是通过体外试验筛选出与GW112 mRNA3'非翻译区(3'UTR)特异性结合蛋白,并研究蛋白性质。
  方法: 以稳定表达GW112基因的胃癌细胞SGC-7901为实验对象,体外转录法获得GW112 mRNA3'非翻译区片段并用生物素标记,结合亲和素磁珠特异性吸附原理,从细胞总蛋白中纯化出与GW112 mRNA3'非翻译区特异性结合蛋白。经过质谱鉴定得到目标条带蛋白信息,并用蛋白印迹(Western blot)验证结果。
  结果: 成功获得含GW112基因3'非翻译区RNA片段,经化学发光法检测后,生物素标记效率高。磁珠纯化的RNA蛋白样品经PAGE电泳银染后,电泳蛋白条带清晰。取目的条带进行质谱分析发现存在核仁素蛋白,以核仁素单克隆抗体进行蛋白印迹(Western blot)验证后发现与质谱结果一致。
  结论: 核仁素是GW112 mRNA3'非翻译区特异性结合蛋白的一种,并很可能对GW112 mRNA稳定性有直接影响,这为进一步揭示GW112在胃癌细胞抗凋亡机制中的作用奠定基础。

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