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C-EPO对创创性脑水肿的保护作用及机制探讨

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摘要

第一部分：氨甲酰化促红细胞生成素对大鼠创伤性脑水肿的影响

1．材料与方法

2 结果

3．讨论

4．结论

第二部分：C-EPO对大鼠颅脑创伤后AQP4表达PKC酸化的影响

1．材料与方法

2 结果

3．讨论

4．结论

第三部分：C-EPO对星形胶质细胞氧糖剥夺／复氧后细胞水肿的影响

1．材料与方法

2 结果

3 讨论

4．结论

第四部分：C-EPO对氧糖剥夺／复氧后星形胶质细胞中PKC和AQP4的影响

1．料与方法

2 结果

3．讨论

4．结论

全文总结

参考文献

文献综述 氨甲酰化促红细胞生成素及其神经保护作用

致谢

攻读学位期间发表论文情况

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摘要

颅脑创伤(TBI)在全身的创伤性疾病中占有非常重要的地位，具有发病率较高、病情危重、预后差等特点，给整个社会与家庭均造成极大的经济和精神负担。而颅脑创伤后的继发性脑损伤中均有不同程度的脑水肿存在，是颅脑创伤患者早期死亡或产生神经功能障碍，影响患者疾病预后重要原因。创伤性脑水肿的机制探索及新的、有效的神经保护药物的研发，一直是国内外学者积极研究的重点和热点。
　　 近二十年大量的研究发现，促红细胞生成素(EPO)不但可以促进红细胞生成，而且有着非常有效的抗凋亡、抑制炎症、促进组织再生修复等保护作用。而EPO相关衍生物——氨甲酰化促红细胞生成素(C-EPO)更是保留了EPO广泛、有效的神经保护功能，又无促进红细胞生成的副作用。C-EPO的发现，为寻找确切有效并且安全可靠的颅脑创伤神经保护药物提供了新方向。但目前，C-EPO是否能减轻创伤后脑水肿及其具体分子机制，国内外尚无深入研究及报道。
　　 本研究拟在建立稳定可靠的SD大鼠重型颅脑创伤模型、体外氧糖剥夺/复氧星形胶质细胞水肿模型的基础上，①观察C-EPO对大鼠颅脑创伤后脑水肿、神经功能、水肿相关蛋白(水通道蛋白4，AQP4)和信号通路（蛋白激酶C，protein kinase C，PKC）等的影响，从行为学，形态学和分子生物学等多方面探讨C-EPO抑制创伤性脑水肿的作用及可能参与的机制;②在体外实验，进一步观察C-EPO对氧糖剥夺/复氧后星形胶质细胞水肿、AQP4及PKC信号通路等的影响，从细胞形态学，超微结构和分子生物学等多方面深入探讨验证C-EPO抑制创伤性脑水肿的具体分子机制。
　　 第一部分:氨甲酰化促红细胞生成素对大鼠创伤性脑水肿的影响
　　 目的:通过观察C-EPO对大鼠急性重型脑外伤后脑水肿和大鼠神经功能的影响，旨在研究其是否有抑制创伤性脑水肿的保护作用。
　　 方法:168只SD大鼠随机分为四组:正常组，假手术组，脑创伤组，C-EPO治疗组。大鼠重型TBI模型造模成功后每天采用腹腔注射100ug/kg的C-EPO或者等体积生理盐水，于伤后6h、24 h、3d和7d获取脑组织;采用mNSS观察大鼠神经功能损伤及恢复情况;干湿重法检测脑组织含水量;E-B法检测血脑屏障通透性变化;HE染色检测伤灶脑组织病理变化。
　　 结果:①脑含水量:C-EPO治疗组大鼠的脑含水量在第6h和1、3d时较脑创伤组明显降低，差异有统计学意义。②EB染色:C-EPO治疗组大鼠脑EB含量较脑创伤组大鼠伤后1、3d时明显降低，差异有统计学意义。③HE染色:rhEPO组与脑创伤组比较，神经细胞水肿减轻，伤灶中心神经细胞受损及坏死区缩小。④mNSS评分:C-EPO治疗组的mNSS评分较脑创伤组在伤后3、7和14d时出现显著性降低，有统计学差异。
　　 结论:C-EPO能显著减轻大鼠重型颅脑创伤后脑水肿，降低血脑屏障通透性，改善大鼠创伤后神经功能的障碍。初步证实了C-EPO对重型颅脑损伤后脑水肿有明显的抑制保护作用。
　　 第二部分:C-EPO对大鼠颅脑创伤后PKC信号通路酸化和AQP4表达的影响
　　 目的：观察C-EPO对SD大鼠急性重型脑外伤后伤灶周边PKC磷酸化及AQP4表达水平的影响，旨在研究探讨其抑制创伤性脑水肿保护作用的潜在分子机制。
　　 方法：168只SD大鼠随机分为四组:正常组，假手术组，脑创伤组，C-EPO治疗组。采用RT-PCR法，检测大鼠急性重型TBI后伤灶周边脑组织中AQP4 mRNA的表达水平;用Western Blot法，检测PKC的磷酸化水平和AQP4蛋白的表达水平;用组织免疫荧光染色法，检测伤灶周边脑组织中AQP4蛋白的表达水平。
　　 结果：①Real-time PCR:脑创伤组伤灶周边脑组织中AQP4 mRNA表达水平明显升高; C-EPO治疗组AQP4 mRNA的表达水平在伤后6h和1、3d时较脑创伤组均明显降低。②WesternBlot法:脑创伤组AQP4蛋白的表达在创伤后出现显著升高，C-EPO治疗组AQP4蛋白在伤后第1、3和7d时较脑创伤组表达明显降低。PKC磷酸化水平在伤后有明显下降，C-EPO治疗可以显著升高创伤后PKC磷酸化的水平。③免疫荧光:脑创伤组AQP4蛋白的荧光表达均较假手术组明显升高，C-EPO治疗组AQP4蛋白的荧光表达明显低于脑创伤组。
　　 结论：大鼠重型颅脑创伤后PKC磷酸化水平出现显著下降，同时AQP4的表达明显增高;C-EPO治疗能显著提高伤后PKC的磷酸化水平，降低颅脑创伤后AQP4的高表达水平。本部分结果充分提示AQP4及PKC信号通路参与了C-EPO抑制创伤性脑水肿的神经保护作用。
　　 第三部分:C-EPO对星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧后细胞水肿的影响
　　 目的：通过观察C-EPO对体外原代星形胶质细胞在氧糖剥夺/复氧(OGD/R)后细胞水肿及损伤情况的影响，旨在研究C-EPO是否能够减轻氧糖剥夺/复氧引起的星形胶质细胞水肿。
　　 方法：体外培养原代星形胶质细胞，并随机分为正常组、OGD/R损伤组和C-EPO治疗组。建立氧糖剥夺/复氧细胞水肿模型，使用C-EPO(10ng/ml)预处理星形胶质细胞。在氧糖剥夺/复氧损伤后0.5 h，2h，8h和24 h时，用光学显微镜观察细胞的形态变化，电子显微镜观察线粒体等超细胞微结构变化，[3H]-3-氧-甲基-D-葡萄糖摄法测定细胞体积变化，乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测细胞损伤及恢复情况。
　　 结果：①光学显微镜: C-EPO治疗组星形胶质细胞在伤后胞体及足突的肿胀情况较OGD/R损伤组明显减轻。②电子显微镜:C-EPO预处理后细胞线粒体肿胀及溶酶体增高等情况明显缓解。③细胞体积:星形胶质细胞在氧糖剥夺/复氧后体积明显增加，C-EPO预处理组的细胞体积明显低于OGD/R损伤组。④LDH漏出率:给予C-EPO预处理后细胞在氧糖剥夺/复氧后的LDH漏出率较OGD/R损伤组明显降低。
　　 结论：本部分实验结果证实了C-EPO预处理能明显减轻体外氧糖剥夺/复氧损伤引起的星形胶质细胞水肿，减轻细胞线粒体肿胀等超微结构的改变。以上实验提示C-EPO能够抑制颅脑创伤后缺血再灌注引起的星形胶质细胞水肿。
　　 第四部分:C-EPO对氧糖剥夺/复氧后水肿星形胶质细胞中PKC磷酸化和AQP4的表达的影响
　　 目的：观察C-EPO及PKC阻断剂（H-7）对氧糖剥夺/复氧后星形胶质细胞水肿、PKC磷酸化及AQP4的表达的影响，旨在研究C-EPO是否是通过调节PKC信号通路磷酸化，降低AQP4表达水平，以减轻氧糖剥夺/复氧后星形胶质细胞水肿。
　　 方法：将细胞随机分为正常组、OGD/R损伤组、C-EPO组和C-EPO+H-7组。用Western Blot法，检测氧糖剥夺/复氧后各组细胞PKC的磷酸化水平和胞膜AQP4蛋白的表达水平;用细胞免疫荧光双标染色法，检测细胞AQP4蛋白的表达水平;用RT-PCR法检测相应细胞AQP4 mRNA的表达水平;测定各组细胞体积和LDH漏出率的变化。
　　 结果：OGD/R损伤组细胞PKC磷酸化水平在氧糖剥夺/复氧后明显下降，同时胞膜AQP4 mRNA和蛋白的表达水平显著升高;C-EPO治疗组后细胞PKC磷酸化的水平明显回升，胞膜AQP4的表达水平也显著下降。与C-EPO组相比，C-EPO+H-7组胞膜AQP4的表达水平则出现明显升高，细胞体积及LDH漏出率明显增加。
　　 结论：本部分实验证实了C-EPO可通过提示氧糖剥夺/复氧后PKC信号通路的磷酸化水平，抑制AQP4的高表达，减轻氧糖剥夺/复氧引起的星形胶质细胞水肿，证实了PKC信号通路和AQP4在C-EPO抑制创伤脑水肿中发挥了重要作用。

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