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【6h】

雌激素受体α对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的抑制作用

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背景:
　　 多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种是以中枢神经系统(Central nervous system,CNS)血管周围炎性细胞浸润为主,可伴有多灶性白质脱髓鞘为病变特征的自身免疫性疾病,目前尚无有效的治疗方法。临床研究的数据表明雌激素可以改善复发,缓解型MS患者的部分生化和临床指标,这提示雌激素或许可以用于治疗MS。雌激素的生理作用由α和β两种亚型的雌激素受体(Estrogen receptor,Er)介导,Er是雌激素产生生物学效应的必要因素。研究发现雌激素抑制EAE炎症反应可能是通过Erα发挥效应,因此脑组织中有关Erα的研究成为人们关注的焦点。
　　 目的:
　　 构建携带C57BL/6小鼠Erα的重组慢病毒。用实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)作为MS的动物模型,将Erα重组慢病毒立体定位注射EAE小鼠侧脑室,拟用Erα过表达的方法初步探讨雌激素和Erα在EAE中的抗炎作用及其作用机制,观察Erα重组慢病毒的疗效。
　　 方法:
　　 使用逆转录一聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chainreaction,RT-PCR)方法从C57BL/6小鼠卵巢细胞中扩增Erα编码序列(Coding sequence,CDS)区基因片段,至pMD19-T载体后测序鉴定。将Erα基因片段插入慢病毒主体载体LV-GFP-flag,构建重组慢病毒载体LV-Erα-flag。通过琼脂糖凝胶电泳(Agarose gel electrophoresis,AGE),基因测序验证后,将LV-Erα-flag与包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共同转染293T细胞,测定病毒滴度,获得携带Erα的重组慢病毒V-Erα-flag。将V-Erα-flag感染293T细胞,western blot方法检测Erα蛋白表达。无血清原代培养小鼠神经细胞,小鼠神经元特异性烯醇化酶(Neuron specific enolase,NSE)免疫组化染色方法鉴定神经元的纯度。用对照病毒V-GFP-flag感染神经细胞,在荧光显微镜下每天观察荧光表达情况,流式细胞仪(Flow cytometry,FCM)检测细胞感染率及凋亡率用于判断最佳MOI。用最佳MOI的重组慢病毒V-Erα-flag感染神经细胞,实时定量PCR和western blot分别检测V-Erα-flag感染的神经细胞中ErαmRNA和蛋白的表达水平。在小鼠侧脑室立体定位注射V-Erα-flag,H&E及flag免疫荧光组织化学染色鉴定V-Erα-flag在体感染C57BL/6 CNS的最佳剂量。100只C57BL/6小鼠行去卵巢术,术后两周用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(Myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)35～55多肽诱发EAE模型,病理和影像学方法鉴定该模型。
　　 实验分为5组:①雌激素组(雌二醇治疗),②Erα激动剂组(雷洛昔芬治疗),③Erα重组慢病毒组(简称Erα组)(Erα重组慢病毒治疗),④空病毒组,⑤生理盐水(Normal saline,NS)组。比较各组小鼠的临床症状及体重的变化。取脑和脊髓,行H&E染色观察炎症反应,westernblot检测髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein,MBP)表达量和勒克斯坚牢蓝(Luxol fast blue,LFB)-H&E染色分析脱髓鞘情况,免疫荧光组织化学染色检测各组EAE小鼠CNS中基质金属蛋白酶9(Matrixmetallopeptidase9,MMP-9)的表达,实时定量PCR及酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA)检测炎性因子MMP-9、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)、干扰素γ(Interferonγ,IFN-γ)、白细胞介素(Interleukin,IL)-23、IL-17和抑炎因子IL-4的表达。
　　 结果:
　　 测序证实扩增的ErαCDS区基因序列完全正确。AGE及测序鉴定均表明重组慢病毒载体构建成功,包装、扩增后得到Erα重组慢病毒V-Erα-flag感染滴度为2×108(TU/ml)。Western blot检测V-Erα-flag感染的293T细胞能表达Erα蛋白,而未受感染的293T细胞不表达Erα蛋白。成功原代培养神经细胞,经NSE免疫组化染色方法鉴定神经元纯度达90％以上。MOI=5的对照病毒V-GFP-flag能感染神经细胞,感染效率达89.8±4.03%而凋亡率仅为3.6±0.29%,神经细胞至少能存活8周,在此期间绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)能持续表达。用MOI=5的V-Erα-flag感染神经细胞后,能显著增强神经细胞中的ErαmRNA和蛋白表达水平。侧脑室立体定位注射15μl-Erα-flag能成功感染C57BL/6小鼠CNS。经病理和影像学方法鉴定EAE模型构建成功。雌二醇、雷洛昔芬及Erα重组慢病毒治疗与空病毒组,NS组相比,可以降低EAE小鼠的发病率,减轻其临床症状和体重丢失,缓解脑和脊髓中炎性细胞浸润和神经纤维的髓鞘脱失。除此以外,还能够使MMP-9、TNF-α、IFN-γ、IL-23、IL-17的表达降低(P＜0.05),MBP和IL-4的表达升高(P＜0.05),雌激素组、Erα激动剂组及Erα重组慢病毒组相比没有显著性差异(P＞0.05)。
　　 结论:
　　 成功构建携带Erα基因的重组慢病毒,感染293T细胞能表达Erα蛋白。MOI=5的V-Erα-flag能有效而稳定感染神经细胞,并上调ErαmRNA和蛋白表达。立体定位注射15μl V-Erα-flag能成功感染小鼠CNS。Erα重组慢病毒治疗EAE小鼠具有和雌二醇、雷洛昔芬相似的疗效,可以降低其发病率,减轻临床症状和体重丢失,缓解脑和脊髓中炎性细胞浸润和髓鞘脱失,抑制EAE小鼠CNS中炎性因子TNF-α,IFN-γ,MMP-9、IL-23、IL-17的表达,增加抑炎因子IL-4的表达。提示雌二醇、雷洛昔芬及Erα重组慢病毒治疗可能通过降低MMP-9、纠正Th1/Th2细胞因子的失衡、抑制IL-23/IL-17轴等机制,减轻EAE小鼠的炎症反应及髓鞘脱失。为MS的治疗提供新的思路。

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