小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的体外实验及nesprins在此分化过程中的表达

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第一部分：小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的体外实验目的：探索提高胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）体外诱导分化为心肌细胞的实验方法。方法： 1.制备原代小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryo fibroblasts，MEF）饲养层。 2.复苏129系小鼠ESC至饲养层上培养，当细胞均匀铺满六孔板底部80％左右，即可按一定比例传代或冻存。 3.取未分化的ESC，分别采用悬滴-悬浮-贴壁三步法（悬滴三步法）和悬浮-贴壁两步法（悬浮两步法），按诱导剂的不同分为Ⅰ组：丹参+5-氮杂胞苷（5-azacytidine，5-aza）组；Ⅱ组：丹参+维甲酸（retinoic acid，RA）组；Ⅲ组：5-aza；Ⅳ组：丹参组；Ⅴ组：RA组；Ⅵ组：阴性对照组6组进行诱导培养，比较在2种培养方法下各组心肌细胞的分化率。 4.采用RT-PCR检测ESC时期、培养d7、d7+9的细胞α-MHC和MLC-2v基因mRNA的表达。 5.采用免疫细胞化学方法检测培养d7+9具有自发搏动的拟胚体（embryoid bodies，EBs）心肌蛋白α辅肌动蛋白（α-actinin）、肌球蛋白（myosin）、肌动蛋白（α-actin）的表达。结果： 1.MEF细胞贴壁生长，排列紧密成短梭形。制备的饲养层可用7～10d。 2.生长在MEF上的ESC呈集落状，显微镜下折光性强，细胞间紧密堆积，细胞界限不清。经过悬滴三步法和悬浮两步法培养后形成的聚集物即EBs成立体球状结构。倒置相差显微镜下观察加入诱导剂第2d（即d7+2）可见自发性收缩，1个EB可有1个或多个收缩中心。 3.Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ组采用悬滴三步法培养的心肌细胞分化率分别为（77.78±5.09）％，（66.67±8.82）％，（51.11±1.92）％，（44.44±5.09）％，（23.33±3.34）％；采用悬浮两步法培养的心肌细胞分化率分别为（42.22±6.94）％，（36.67±8.82）％，（25.55±10.71）％，（17.78±5.09）％，（10.00±2.84）％。各组心肌细胞分化率悬滴三步法较同组悬浮两步法高，差异具有统计学意义（P<0.05）。采用悬滴三步法培养Ⅰ组心肌细胞分化率最高，与其它各组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。 4.RT-PCR结果显示心肌特异性基因α-MHC在d7开始表达，心室肌特异基因MLC-2v在d7+9有表达。 5.免疫细胞化学示心肌特异性结构蛋白α-actinin、myosin、α-actin均成阳性表达。结论：悬滴三步法联合采用中药丹参与5-aza为诱导剂，可提高体外ESC分化为心肌细胞的分化率。第二部分：Nesprins基因在小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞过程中的表达目的：研究nesprins基因在小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）分化为心肌细胞过程中的表达，探讨nesprins基因在心肌细胞发育过程中的作用。方法： 1.体外培养小鼠ESC，采用悬滴-悬浮-贴壁三步法（悬滴三步法），以5-氮杂胞苷（5-azacytidine，5-aza）为诱导剂促ESC分化为心肌细胞。 2.采用RT-PCR和免疫细胞化学方法鉴定心肌细胞。 3.采用RT-PCR检测ESC时期、培养d7、d7+3、d7+6、d7+9、d7+20的细胞nesprin-1、nesprin-2基因mRNA的表达。 4.采用免疫荧光检测ESC时期、培养d7、d7+3、d7+6、d7+9、d7+20各时间点nesprin-1蛋白在细胞中的定位。结果： 1.生长在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上的ESC呈集落状，相差倒置显微镜下折光性强，细胞间紧密堆积，细胞界限不清。经过悬滴三步法培养后形成的拟胚体（embryoid bodies，EBs）成立体球状结构。以5-aza为诱导剂在分化d7+2可见自发性收缩，1个EB可有1个或多个收缩中心。 2.RT-PCR结果显示心肌特异性基因α-MHC在d7开始表达，心室肌特异基因MLC-2v在d7+9有表达。免疫细胞化学示心肌特异性结构蛋白α-辅肌动蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白均成阳性表达。 3.Nesprin-1、nesprin-2基因mRNA在ESC分化为心肌细胞过程中均有表达且呈动态变化；Nesprin-1基因mRNA在ESC培养到d7+6时期表达逐渐增高，随后呈下降趋势，在d7+20时表达最低（P<0.05）；Nesprin-2基因mRNA在培养d7时表达最高，与其它各时间点有显著性差异（P<0.05），且随着分化时间的延长逐渐下降，在d7+20时表达最低。结论： Nesprin-1、nesprin-2在ESC分化为心肌细胞过程中表达呈动态变化，其表达高峰在分化早期和中期，与心肌细胞增殖及传导系统发育有关，推测nesprins在维持心肌细胞发育，使ESC更完全的向心肌细胞分化过程中起重要作用。

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作者
王芳洁;
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作者单位

重庆医科大学;

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授予单位重庆医科大学;
学科儿科学(心血管内科)
授予学位硕士
导师姓名易岂建;
年度 2009
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类心肌疾病;小儿心脏、血管疾病;
关键词
心肌病; 胚胎干细胞; 心肌细胞; 细胞分化; 蛋白表达; Nesprins;

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