幽门螺杆菌外膜蛋白Omp26重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗的研究

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幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）为定植于人胃黏膜的一种微需氧、螺旋状的革兰阴性杆菌，已被公认为是慢性胃炎、胃十二指肠溃疡的重要病因，并与胃癌、胃黏膜相关性淋巴样组织（MALT）淋巴瘤的发生密切相关，1994年被世界卫生组织定为Ⅰ类致癌原（gradeⅠ carcinogen）。由于Hp的感染率极高，预防和治疗Hp感染成为消化领域和医学微生物界的研究热点。目前常用的治疗方案是抗生素加质子泵抑制剂或/及铋剂的“三联”、“四联”疗法，但药物治疗存在一定的不良反应，停药后易复发，治疗费用较高，患者依从性差及耐药菌株的不断增加等问题使其发展受到限制，而疫苗将是预防和治疗Hp感染最经济有效的方法。Hp蛋白疫苗的免疫原性较低，只有与各种强效的免疫佐剂一起接种时才具有保护作用，但这些佐剂存在较大的毒副作用而限制了其进一步发展，而重组活载体疫苗可有效解决这一难题。Hp活载体疫苗为预防和治疗Hp感染提供了一种新的策略。本研究主要分为四个部分：第一部分：幽门螺杆菌Omp26重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗株的构建。目的：采用基因工程技术构建幽门螺杆菌外膜蛋白Omp26大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体，并在耻垢分枝杆菌中进行表达，筛选稳定表达幽门螺杆菌Omp26的重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗株，为进一步探讨其防治Hp感染奠定基础。方法：利用PCR技术，以pET32a-Omp26为模板扩增Omp26基因片段，PCR产物胶回收后与载体pMD18-T连接，通过PCR、限制性酶切分析和测序鉴定阳性重组载体，然后将测序正确的重组载体经kpnⅠ和NotⅠ双酶切后亚克隆至大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pLA71、pLA73、pJMas和pJHsp70中，构建分泌型和非分泌型大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体，利用电穿孔方法将其转入M.s中，构建重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗株（rM.s），通过PCR、限制性酶切分析鉴定所构建的rM.s疫苗株的正确性，SDS-PAGE及Western blot对其表达的蛋白进行分析。结果：采用PCR方法从pET32a-Omp26中扩增出约594bp的DNA片段，目的片段与pMD18-T载体连接后测序结果示插入的基因片段为Hp Omp26编码基因，由594bp组成，与GenBank中菌株HP AY033499序列同源性达98.8％。将测序正确的重组T载体分别亚克隆入质粒pLA71，pLA73，pJMas，pJHsp70中，构建分泌性和非分泌性穿梭表达载体，PCR和酶切鉴定穿梭表达载体构建成功。将表达载体利用电穿孔的方法导入M.s中，经卡那霉素抗性筛选、限制性酶切分析和PCR鉴定rM.s株构建成功。重组质粒pPL71-Omp26，pPL73-Omp26在M.s中表达的蛋白可分泌到细菌培养上清中，Western blotting在细胞培养上清中能检测到Omp26。重组质粒pJMas-Omp26和pJHsp70-Omp26由于缺乏信号肽，所表达的蛋白仅存在于细菌沉淀中。结论：成功构建了重组大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pPL71-Omp26，pPL73-Omp26，pJMas-Omp26和pJHsp70-Omp26；成功构建了稳定表达幽门螺杆菌Omp26的重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗株。第二部分：幽门螺杆菌Omp26重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗株体内外稳定性及安全性研究目的：研究幽门螺杆菌Omp26耻垢分枝杆菌活载体疫苗株在小鼠体内外的稳定性及在小鼠体内的定植，并对疫苗的安全性进行评价。方法：将绿色荧光蛋白质粒电转化入构建好的重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗中，经体外传代培养，随机挑取20个菌落观察荧光表达及提取质粒判断重组质粒的稳定性；灌胃免疫BALB/c小鼠，免疫4周和8周后处死小鼠，对小鼠各内脏器官行组织学检查，并对各组织内细菌进行活菌计数及质粒提取，以判断重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗体内的稳定性及安全性。结果：体外稳定性研究结果表明重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗在体外具有高度稳定性，在有卡那霉素抗性存在和无选择性压力情况下均可连续传代20次而不发生质粒丢失。应用rM.s灌胃免疫BALB/c小鼠后无明显的毒副作用出现，重组活载体疫苗可稳定地存在于胃、脾脏、肺和肝脏。结论：绿色荧光蛋白为观测rM.s在体内的定植提供了更为直观的手段。rM.s在体内外具有高度的稳定性，无明显毒副作用。第三部分：重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗预防幽门螺杆菌感染的研究。目的：通过动物模型评价重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗预防幽门螺杆菌感染的效果，明确其预防幽门螺杆菌感染的作用机制。方法：选择标准化实验动物SPF级BALB/c小鼠构建Hp定植模型，将2×107 CFUs重组M.s疫苗（pPL73-Omp26）灌胃免疫BALB/c小鼠，同时设PBS对照组、M.s空菌组，免疫4w后，各组处死一批小鼠，取血清、胃、脾组织待用；余下的小鼠用Hp SS1攻击2次，4w后处死小鼠，行快速尿素酶试验，Hp定量培养，组织病理学检查以评价疫苗预防胃黏膜Hp感染的免疫保护作用。MTT检测脾淋巴细胞增殖；RT-PCR检测小鼠胃粘膜和脾组织中Th1细胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-12）与Th2细胞因子（IL-4、IL-6、IL-10）的表达；ELISA检测血清Hp特异性IgG，IgA，IgG1和IgG2a抗体水平。结果：rM.s（pPL73-Omp26）疫苗组胃黏膜中Hp数量明显低于PBS对照组和空菌组，rM.s（pPL73-Omp26）疫苗组不仅可以降低Hp的定植，而且能减轻Hp造成的小鼠胃黏膜的局部慢性炎症反应。用ConA和Hp抗原刺激后rM.s疫苗组小鼠脾淋巴细胞明显增殖。免疫后BALB/c小鼠特异性抗体显示rM.s（pPL73-Omp26）疫苗组诱导血清Hp特异性抗体IgG、IgA、IgG1和IgG2a水平均升高，以IgG2a占优势。RT-PCR结果示，疫苗灌胃免疫后4周，空菌组和重组疫苗组小鼠胃和脾淋巴细胞IL-2，IFN-γ表达量显著增加，PBS对照组无IL-2，IFN-γ表达。受Hp攻击后4周对照组和疫苗组小鼠胃组织和脾淋巴细胞IFN-γ，IL-2和IL-4均有不同程度的的表达，PBS对照组出现以IFN-γ为主的增生，空菌组出现以IL-2为主的增生，IFN-γ和IL-2水平显著高于rM.s疫苗组（P<0.05）；而rM.s疫苗组则出现以Th2细胞（IL-4）为主的增生，IL-4水平显著高于PBS对照组和空菌对照组（P<0.05），各实验组H攻击前后均未见IL-12，IL-10，IL-6的表达。结论：rM.s疫苗经灌胃免疫BLAB/c小鼠后不仅能降低Hp定植，而且能减轻小鼠胃黏膜的局部慢性炎症反应，对Hp感染有明显的预防保护效果。该疫苗的作用机制可能是诱导Th1和Th2两种细胞平衡型免疫应答。第四部分：重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗治疗幽门螺杆菌感染的研究。目的：通过动物模型评价重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗对幽门螺杆菌感染小鼠的治疗效果，明确其治疗幽门螺杆菌感染的作用机制。方法：建立幽门螺杆菌感染BALB/c小鼠动物模型，感染4周后将2×107 CFUs重组M.s（pPL73-Omp26）疫苗灌胃免疫幽门螺杆菌感染BALB/c小鼠，对照组用PBS或M.s空菌，免疫4w后处死小鼠，行胃组织快速尿素酶试验，Hp定量培养，组织病理学检查以评价疫苗对胃黏膜Hp感染的免疫治疗作用。MTT检测淋巴细胞增殖；RT-PCR检测小鼠胃粘膜和脾组织中Th1细胞因子（INF-γ、IL-2、IL-12）与Th2细胞因子（IL-4、IL-6、IL-10）的表达；ELISA检测血清Hp特异性抗体IgG，IgA，IgG1和IgG2a水平。结果：rM.s（pPL73-Omp26）疫苗治疗组小鼠胃黏膜中Hp数量明显低于感染对照组和空菌组，rM.s（pPL73-Omp26）疫苗不仅可以降低Hp的定植，而且能减轻Hp，造成的小鼠胃黏膜的局部慢性炎症反应。治疗后四周ConA，刺激后各实验组脾淋巴细胞均有不同程度的增殖，与感染对照组和空菌对照组相比，rM.s（pPL73-Omp26）疫苗治疗组小鼠脾淋巴细胞增殖更明显（P<0.05）。治疗后BALB/c小鼠特异性抗体检测示rM.s（pPL73-Omp26）疫苗治疗组小鼠血清Hp特异性抗体IgG，IgA，IgG1和IgG2a均明显高于感染对照组和空菌组（P<0.001）。RT-PCR证实，各实验组胃和脾组织IFN-γ，IL-2，IL-4均有不同程度的表达，但rM.s（pPL73-Omp26）疫苗治疗组IFN-γ，IL-2，IL-4水平明显高于感染对照组和空菌组，各实验组均未见IL-6，IL-12和IL-10的表达。结论：成功建立了BALB/c小鼠的Hp感染模型，rM.s（pPL73-Omp26）疫苗经灌胃免疫Hp感染BLAB/c小鼠能明显降低Hp定植，减轻胃黏膜的炎症反应，对Hp感染有一定的治疗作用。其免疫治疗机理可能是rM.s产生以Th1细胞和Th2细胞协同作用的保护性免疫应答。

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作者
吕琳;
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作者单位

重庆医科大学;

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授予单位重庆医科大学;
学科内科学(消化内科)
授予学位博士
导师姓名王丕龙;
年度 2009
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类十二指肠疾病;胃炎;
关键词
幽门螺杆菌; 活载体疫苗; 耻垢分枝杆菌; 胃十二指肠溃疡; 慢性胃炎; Omp26基因片段;

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