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儿童感染青霉素耐药肺炎链球菌的多位点序列分型及青霉素结合蛋白基因突变分析

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摘要

目的：
　　对儿童感染的青霉素耐药肺炎链球菌(PRSP)进行多位点序列分型和青霉素结合蛋白基因突变分析，了解肺炎链球菌(SP)耐药菌株遗传背景，及青霉素结合蛋白基因突变与青霉素耐药之间的关系。
　　方法：
　　（1）自10525例儿童呼吸道标本分离出青霉素MIC=2.0μg/mL、4.0μg/mL和≥8.0μg/mL的肺炎链球菌各20株共60株，作为本研究的实验菌株。采用Optochin进行初筛试验，Phoenix-100全自动微生物鉴定/药敏分析系统及配套的链球菌鉴定药敏板进行肺炎链球菌的鉴定和药敏试验，同时采用E-test法进行青霉素药敏结果的验证。
　　（2）采用BioFast土壤基因组DNA提取试剂盒提取肺炎链球菌总DNA。
　　（3）多位点序列分型：根据MLST网站提供的引物序列，对肺炎链球菌7个看家基因（aroE、gdh、gki、recP、spi、xpt和ddl）分别进行PCR扩增。扩增产物进行纯化和测序，测序结果经修正后应用MegAlign软件与标准序列进行比对。截取标准长度的分析序列提交网站确定等位基因型和ST（Sequence type）分型，并使用eBURST V3软件分析菌株之间的亲缘性关系。
　　（4）PBPs基因PCR扩增：以肺炎链球菌DNA为模板对PRSP青霉素结合蛋白6个基因（pbp1a、pbp1b、pbp2a、pbp2b、pbp2x、pbp3）分别进行PCR扩增。扩增产物进行纯化和测序，测序结果使用MEGA7.0软件与青霉素敏感肺炎链球菌R6（DDBJ/EMBL/GeneBank accession number NC003098)进行序列比对分析,重点与目前国际上公认的PBPs保守序列进行比对分析。
　　结果：
　　（1）10525例儿童痰标本共检出5872株病原菌，阳性率55.8%，其中检出肺炎链球菌1317株，检出率为12.5%，占病原菌总数的构成比为22.4%，均居首位。
　　（2）SP对红霉素、克林霉素和四环素耐药率分别高达98.2%、95.4%和95.3%，青霉素耐药率64.2%（MIC≥2μg/mL），其他β-内酰胺类抗菌药物呈现不同程度的耐药率
　　（3）60株PRSP共分出24个ST型，6个新的ST型，存在一个优势型别ST271，占31.7%（19/60），eBURST进行同源性分析，发现了4个克隆群和20种单一克隆，其中一个主要克隆群为流行克隆群CC271，属于国际流行耐药克隆株（PMEN）复合体（Taiwan19F－14complex[14]），该PMEN14克隆群共25株，占总菌株数的41.7%。
　　（4）PBP3、PBP1b序列未发现突变，PBP2b、PBP1a、PBP2x、PBP2a基因的保守区或保守区附件均发现氨基酸突变。
　　结论：
　　（1）肺炎链球菌是儿童感染性肺炎的重要病原菌，耐药情况严重，阿莫西林和注射青霉素较为敏感，为治疗首选用药。
　　（2）PRSP的优势型别为ST271，PMEN14克隆群为本地区耐药的主要原因。
　　（3）肺炎链球菌的高水平耐药与PBP2b、PBP2a、PBP1a的变异存在密切关系。
　　（4）PBP1a的变异是导致肺炎链球菌高水平耐药的补充因素而非必要因素。
　　（5）肺炎链球菌出现中、高水平耐药时，绝大部分合并有不同PBP序列中4-6个氨基酸的置换突变，但合并多个氨基酸置换突变并非就必然引起耐药水平相应的升高，PBP2a序列的Ser461Ala置换和PBP2b序列的Thr451Ala/Ser置换可能起到主导作用。
　　（6）本地区PRSP中的PBP3与PBP1b保留高度保守，未发现基因突变。

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