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中国人面肩肱型肌营养不良症的临床表型及基因突变分析

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附录英文缩略词表

第一部分 中国面肩肱型肌营养不良症的临床和基因型分析

前言

材料与方法

1研究对象

2主要实验材料、试剂及仪器

结果

1临床表型总体特征

2 FSHD的DUX4基因分布情况

3 EcoRI片段与FSHD辅助检查的关系

讨论

第二部分 面肌不受累的面肩肱型肌营养不良症的临床表型和基因结构特征

前言

材料和方法

1 研究对象

2 主要实验材料、试剂及仪器

3 统计学分析

结果

1 SHD的临床评估和辅助检查的特点

讨论

参考文献

综述：面肩肱型肌营养不良的临床特点和研究进展

致谢

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摘要

背景与目的：
　　面肩肱型肌营养不良（Facioscapulohumeral muscular dystrophy，FSHD）是一种常染色体显性遗传性肌病，发病率约为1/20000，仅次于假肥大型肌营养不良（DMD）和强直性肌营养不良（DM）。FSHD一般青少年期起病，主要表现为面肌、肩胛带肌及上臂肌群的不对称肌无力和肌萎缩，可以逐步向下发展至下肢肌群，一半以上不对称分布，典型体征包括肌病面容、翼状肩胛，Beevor’s征等。FSHD进展相对缓慢，预后较好，但约20%患者最终需依靠轮椅，少数严重者合并肌肉外表现，包括感音神经性听力损害、视网膜血管病变、癫痫等。FSHD致病机制复杂，基因定位于4q35亚端粒区，超过95%的患者与该区域内的一段D4Z4大卫星重复序列的多拷贝缺失有关（<10拷贝），导致相应的多态性EcoRI片段缩短至10-38kb，导致该区域去甲基化和染色体构象改变，从而使内部基因功能失调。同时，此D4Z4序列连锁了上游的特异序列SSLP和下游4qA单体型才能致病。我们前期证实了中国人FSHD的致病基因型为4qA161PAS，准确检测此型的D4Z4片段是FSHD分子诊断的结构基础。由此可见，FSHD分子检测流程不同于多数单基因遗传病的直接或高通量基因测序，需要采用大片段DNA分离及杂交等方法，相对复杂和特殊，少有实验室专项开展，导致缺少完整的中国人FSHD临床表型和突变基因分析。与此同时，FSHD表型存在明显的家族内和家族间的异质性，除常见的典型FSHD外，存在相当一部分非典型FSHD患者，容易导致误诊或漏诊，此类以面肌无显著受累者（又称SHD，易误诊为肢带型肌营养不良（LGMD））最为常见。本研究在建立规范化FSHD临床采集和分子诊断流程的基础上，对我国242个FSHD家系进行统计，分析中国人FSHD的临床表型以及基因突变特点，总结临床表型-基因型关系，继而对特殊类型FSHD进行临床和分子遗传学研究，以提升对本病的总体认识。
　　研究对象和方法：
　　1.研究对象：332例 FSHD患者，来自242个无亲缘关系的家系，籍贯分布于23个省市，其中中国南方170个，北方72个，均为汉族。其中30例为早发型FSHD。先证者的临床诊断符合Padberg GW等提出的诊断标准，并进行CSS评分评估表型，总结相关辅助检查结果，本研究符合医院伦理委员会规定，均取得知情同意。
　　2.分子检测流程；符合2015年《neurology》的指南。低熔点胶包埋抽提DNA，胶块DNA分别经 EcoRI酶切， EcoRI/BlnI酶切和 HindIII酶切，进行脉冲场凝胶电泳，分别与预先标记探针P13E-11、4qA或4qB杂交，根据marker计算EcoRI酶切片段来源（4q35/10q26亚端粒区来源）的长度，确定片段连锁等位基因类型（4qA/4qB），嵌合体需计算致病EcoRI片段灰度评分。
　　3. FSHD的临床和基因特点统计：发病年龄、EcoRI片段、生化指标等均符合正态分布，用均数与标准差描述（Mean±SD）；临床严重程度与EcoRI片段的相关性、嵌合体片段灰度评分与临床表型严重程度的相关性均采用 Spearman秩相关进行分析；不同组别的发病年龄、EcoRI片段的比较均采用独立样本t检验。P值以小于0.05有统计学意义。统计软件为SPSS16.0。
　　4. SHD的临床评估和分子遗传学分析：20例SHD患者（男14/女6），年龄22-53岁，4例患者的子代呈典型FSHD，进行规范化临床评估，采用焦磷酸测序对SHD亲子代之间进行DR1甲基化水平检测。
　　结果：
　　1.中国FSHD发病以青少年时期多见（17.8±7.6岁），71%患者20岁前外显，91%患者30岁前外显，42例为无症状携带者或症状前患者。290例有临床症状的FSHD患者中，69.3%肩胛起病，22.4%面肌起病，7.9%下肢近端起病。58.7%患者为肌群不对称受累。中国FSHD患者主要累及三角肌、肱二头肌和肱三头肌等近端肌群，腕屈肌和腓肠肌回避。82.2%呈典型翼状肩， Beevor’s征在典型 FSHD患者中阳性率为56%，非典型的SHD患者中阳性率降至35%。9例（3.7%）需依靠轮椅，平均依赖年龄为25.7±13.5岁。242个先证者的临床严重程度评分年龄矫正的 CSS评分平均为229.48±121.1，存在南北差异（F=5.065，P<0.05）。15例女性患者诉妊娠或分娩后发病或病情加重。
　　2.242个先证者及其90例家属携带有小于38kb的4qA型EcoRI片段。阳性家族史有121例，散发病例111例，26例为肯定当代突变（De novo）。先证者平均EcoRI片段为20.0±5.2kb。早发型FSHD的 EcoRI片段为18.2±5.3kb，有家族史者的EcoRI致病片段比散发者的长（P<0.05）。特殊的基因型嵌合体17例，占7%，嵌合体患者总体平均EcoRI片段为18.4±4.6 kb，男女嵌合体的CSS评分存在显著的统计学差异（F=5.46,P<0.05）。
　　3. EcoRI片段大小与临床表型严重程度呈轻微负相关（r=-0.278,P<0.05），其中散发性 FSHD的 EcoRI片段大小与年龄矫正的 CSS评分呈中度负相关（r=-0.482,P<0.05），其相关性相对家族性FSHD明显升高。男女独立分析结果提示二者关系同样呈轻微负相关。嵌合体患者年龄矫正的CSS评分与致病片段灰度评之间呈中度正相关（r=0.529,P<0.05）。女性嵌合体患者临床表现比男性轻（F=5.46,P<0.05），但女性嵌合体子代的表型明显加重。
　　4.相关辅助检查分析：心肌酶中肌酸激酶（CK）轻度升高，为正常值的3倍，肌红蛋白轻度升高，比正常值稍高（未高至1倍），但肌酐值降低。四肢肌电图基本上呈肌源性损害（174/187），面肌肌电图呈肌源性损害(11/48)。FSHD患者肌肉病理大多表现为肌营养不良改变(54/66)。双下肢肌肉 MRI提示不同肌群的萎缩和变性，具有不对称特征，与 MMT检查基本一致。心电图异常以不完全右束支传导阻滞最常见。肺功能检查中7例（6.3%）重度限制性通气障碍的患者,临床严重程度评分（CSS）平均为3.9±0.2，平均EcoRI片段大小为15.7±5.2kb。
　　5.20例SHD患者证实存在D4Z4的缺失，22岁至53岁，起病年龄25.97±8.2岁，随访年限平均2.3±2.8年，表现为进行性的肩胛带及上臂肌无力，下肢肌群几乎不受累。Beevor’s征阳性率（35%）相对典型 FSHD低。SHD患者的后代表型明显比亲代重。生化指标以及辅助检查表现为轻度肌源性损害。其中12例行面肌肌电图（F-EMG），除3个轻度肌源性改变，其余9例F-EMG显示正常。其本组致病EcoRI片段大小为26.7±4.3kb（4-8 D4Z4拷贝），6例存在4q和10q之间的易位。SHD亲子代分别甲基化检测揭示无症状携带者（carrier）的甲基化水平比后代高出1倍，然而轻度受累的SHD患者的甲基化水平与明显加重的子女相近。
　　结论：
　　1.我国FSHD多为青少年起病，以肩胛带肌无力萎缩为首发症状居多。
　　2.半数患者肌群不对称受累，受累肌群频率最高者为三角肌、肱二头肌和肱三头肌等近端肌群；各项体征中，肌病面容、翼状肩和Beevor’s征的比率较高。
　　3.致病性EcoRI片段分布范围9kb到34.5kb(20.0±5.2kb)，存在种族差异性。
　　4.早发型患者携带的EcoRI片短相对较短；EcoRI片段越短，表型越重；散发性FSHD比家族性FSHD的表型严重程度更易EcoRI片段大小的影响，提示尽早明确致病片段长度有助于对病情的评估。
　　5.中国人群存在嵌合体型 FSHD，提示本病除了当代突变外，存在体细胞突变；无临床表型女性嵌合体型FSHD的后代可能遗传致病片段而患病；致病片段所占比例越高，表型越重。
　　6.对于EcoRI片段短、临床表型重的患者，其心肺功能明显受累，注意定期监测。
　　7. SHD患者同样存在4q35区域4qA型EcoRI片段的缩短，归属于FSHD的特殊类型，其表型相对典型 FSHD轻，D4Z4缺失范围较小，翼状肩、Beevor’s征以及不对称受累体征有助于识别和鉴别。甲基化水平差异不是导致SHD代际表型差异的主要原因。

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